姜黃素對HIV-1輔助受體CCR5啟動子的干預作用①

李志慧 馮 龍 鄭文錦 孫 穎 夏金嬋 梅 雪 江 華 李曉娟

（河南中醫藥大學醫學院，鄭州450046）

獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）引起的傳染性疾病。HIV-1 進入靶細胞需要兩種受體：主要受體CD4 和輔助受體CCR5（或CXCR4）[1］。輔助受體CCR5（或CXCR4）首先與CD4 分子結合，形成二聚復合體，然后HIV gp120 再與輔助受體結合，使其發生構象改變，暴露gp41 位點，從而引發HIV 病毒包膜與靶細胞膜的融合[2-4］。趨化性細胞因子受體CCR5（CC-chemokine receptor 5，CCR5）作為嗜巨噬細胞性HIV-1 病毒的輔助受體，近年來備受關注。因此，干預CCR5 的啟動子，阻斷HIV 早期感染，為防治艾滋病帶來了新希望。

姜黃素是從傳統中藥姜黃根莖中提取的活性成分，具有強大的抗腫瘤、抗炎、抗氧化功能[5］。近年研究發現，姜黃素可以使慢性感染HIV-1和HSV-2的T細胞和原代人類生殖器上皮細胞的病毒復制顯著降低[6］。同時，姜黃素也是HIV 整合酶和蛋白酶的抑制劑[7］。因此，姜黃素的分子結構可以作為抗HIV 新藥設計的結構基礎，具有開發潛力。但姜黃素抑制HIV 感染輔助受體CCR5 的確切機制仍然沒有探明，欠缺明確的科學證據。因此，本研究采用雙熒光素酶報告基因技術，以螢火蟲熒光素酶作為報告基因，用于反映CCR5 啟動子的活性。載體下游重組入海腎熒光素酶（hRluc）基因，作為本底對照報告基因。通過序列分析，發現由于hRluc 單元具有兩個SV40 增強子，使hRluc 基因表達活性較強，削弱了上游螢火蟲熒光素酶的表達，使得雙熒光素酶報告基因表達載體不能真實反映出上游CCR5 啟動子的活性[8］。因此，本實驗對雙報告系統進行優化，通過PCR 技術，擴增出了保留hRluc 單元中SV40 部分片段的基因片段（命名該基因片段為Rluc）。將CCR5 啟動子基因片段和Rluc 基因片段分別克隆入pGL4.10 表達載體，成功構建重組載體pFireRluc-CCR5，提高了雙熒光素酶報告基因技術的靈敏性和準確性。將該重組載體瞬時轉染293T細胞，姜黃素對CCR5 啟動活性的影響可以通過海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶活性的比值表達。本實驗通過雙熒光素酶的比值反映出姜黃素對趨化因子受體CCR5啟動子活性起到抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎上皮細胞系293T細胞購自中國典型培養物保藏中心。姜黃素購自Sigma-Aldrich公司（批號：LRCOS107），用無水乙醇配制成10 μmol/L 的母液，使用時稀釋到所需濃度。質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、清潔試劑盒購自Axy-Gene 公 司（批 號 分 別 為08218KA1、25917KE1、33914KB1）；pGL4.10 質粒、pGEM-T 載體、E1960 熒光檢測試劑盒均購自Promega 公司（批號分別為0000185341、0000172570、0000306998）；Cell Count‐ing Kit-8 細胞增殖-毒性測試試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司（批號：NN699）；引物合成及序列分析由上海生工生物工程有限公司完成；普通PCR 儀購自美國Labnet；隔水式恒溫培養箱購自上海精宏公司；低溫高速離心機購自德國Eppendorf；多功能微孔板測讀儀購自德國Berthold；酶標儀及凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胚腎上皮細胞系293T細胞培養于10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素的DMEM 培養基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中。每2～3 d更換一次培養液，細胞達80%～90% 生長融合時，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，接種于6孔板、96孔板或培養瓶中用于實驗研究及傳代。

1.2.2 引物設計 以pmir GLO 載體為模板進行PCR 擴增，獲得Rluc 表達單元。以人基因組為模板進行PCR 擴增，獲得CCR5 啟動子表達單元，引物序列如表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.3 pFireRluc-CCR5 載體構建 使用分子克隆技術，構建pFireRluc-CCR5表達載體：①PCR獲得目的基因片段：根據Rluc 基因編碼區序列設計特異引物Rluc-F、Rluc-R，根據CCR5 啟動子基因編碼區序列設計特異引物CCR5-F、CCR5-R。抽取健康人血液，用血液基因組DNA 提取試劑盒提取人基因組模板，以人DNA 為模板PCR 擴增出CCR5 啟動子基因片段，以pmir GLO 載體為模板擴增加出Rluc表達單元，如表1。 ②構建重組載體pGEM-T-CCR5 和pGEM-T-Rluc：DNA 連接酶分別將CCR5 和Rluc 表達單元與pGEM-T 載體連接，獲得重組載體pGEMT-CCR5 和pGEM-T-Rluc，分別將其轉化入感受態細菌DH5α，并進行氨芐青霉素篩選。③構建重組載體pFireRluc：用限制性內切酶SalⅠ對pGEMT-Rluc和pGL4.10進行單酶切，并對雙黏載體pGL4.10進行去磷酸化處理，用T4 DNA 連接酶將Rluc 表達單元與磷酸化的pGL4.10 進行連接，轉化入感受態細菌DH5α。④酶切鑒定正反插入：挑選pFireRluc 陽性克隆，用StuⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定正反插入，若正向插入則送上海生工測序，測序正確獲得雙熒光素酶報告基因表達載體pFireRluc。⑤構建重組載體pFireRluc-CCR5：用限制性內切酶XhoⅠ和NheⅠ對pGEM-T-CCR5 和pFireRluc 進行雙酶切，用T4 DNA連接酶將CCR5表達單元與磷酸化的pFireRluc雙黏載體進行連接獲得重組載體pFireRluc-CCR5，轉化入感受態細菌DH5α。挑選pFireRluc-CCR5 陽性克隆，送上海生工測序，測序正確獲得雙熒光素酶報告基因表達載體pFireRluc-CCR5。

1.2.4 CCK-8法測定姜黃素對293T細胞的毒性細胞培養至對數生長期時進行實驗，制備5×104個/L的細胞懸液，接種于96 孔板中，每孔加入100 μl 細胞懸液，24 h 后加入含不同濃度姜黃素（10、20、40、60、80 μmol/L）的完全培養基（每孔設3 個復孔）。于加藥24 h 后進行CCK-8 比色實驗。每次于比色前1 h，每孔加入CCK-8 溶液10 μl，繼續培養1 h 后，在450 nm 處進行吸光度OD 值測定。計算各實驗組抑 制 率（%）=OD（對照組?實驗孔）/OD（對照孔?空白孔）×100%。 此實驗重復3次。

1.2.5 細胞分組及轉染 根據CCK-8 檢測結果將293T 細胞分組：對照組（Control）為不轉染pFire-Rluc-CCR5 的293T 空細胞、無水乙醇對照組（Alco‐hol）、實驗組（0、10、20、40、60、80 μmol/L 姜黃素）。轉染步驟參照脂質體LipofectamineTM2000 轉染說明進行。轉染前1 d 以3.6×105個/孔細胞接種于6 孔板，置于體積分數10% 胎牛血清（FBS）的細胞培養基中，5%CO2、37℃常規培養。 細胞融合率達到60%～70% 時，用脂質體包裹轉染質粒pFireRluc-CCR5 入293T 細胞中，轉染6 h 后，更換體積分數10% 胎牛血清（FBS）的細胞培養基，加入一定濃度的姜黃素繼續培養24 h。

1.2.6 雙熒光素酶活性的檢測 姜黃素作用于已轉染pFireRluc-CCR5 的293T 細胞，5%CO2、37℃常規培養24 h 后，收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書步驟操作，用Glomex20/20 檢測儀檢測各組細胞的海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶熒光值，每個藥物濃度分別設置3個復孔。

1.3 統計學處理 實驗結果采用GraphPad Prism 8統計軟件，以單因素方差分析的方法，分析加藥實驗組與對照組間差異是否具有顯著性，選取P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Rluc 表達單元和CCR5 啟動子表達單元擴增結果 提取人基因組DNA 后，PCR 擴增，膠回收獲得Rluc 和CCR5 啟動子基因片段，電泳結果顯示：2000 bp及1000 bp處下側各見一條陽性條帶，與引物設計的目的片段Rluc和CCR5啟動子的理論大小相對應，表明Rluc 和CCR5 啟動子的基因片段擴增成功（圖1）。

圖1 重疊PCR得到Rluc表達單元和CCR5啟動子表達單元Fig.1 Overlapping PCR to obtain Rluc and CCR5 pro?moter expression unit

2.2 pFireRluc-CCR5 重組載體的酶切鑒定結果核酸內切酶酶切鑒定正反插入結果pFireRluc 重組載體大小為6239 bp，經StuⅠ、XbaⅠ雙酶切，正向連接者產生5935 bp 和304 bp 兩個片段，如圖2 所示，證實pFireRluc 為正向插入克隆。測序結果進一步證實克隆入載體的Rluc基因和CCR5啟動子基因符合實驗設計的要求，且無移碼突變和點突變，部分測序結果如圖3、4。

圖2 酶切后的pFireRluc-CCR5分子Fig.2 pFireRluc-CCR5 molecule after digestionNote：M.Marker；1.SalⅠdigestion result；2.StuⅠ，XbaⅠdouble enzyme digestion result.

圖3 Rluc表達單元的測序結果圖Fig.3 Sequencing results of Rluc expression unit

圖4 CCR5啟動子表達單元的測序結果圖Fig.4 Sequencing results of CCR5 promotor expression unit

2.3 姜黃素對293T細胞的毒性作用 為了探究姜黃素對293T細胞活性的影響，采用CCK-8檢測細胞活性。實驗結果顯示：當姜黃素濃度低于80 μmol/L時，293T 細胞存活率維持在80% 以上，對293T 細胞的活性無明顯影響；當濃度達到100 μmol/L 時，細胞活性降至80% 以下（圖5）。因此，本研究選擇了對細胞無顯著毒性的10、20、40、60、80 μmol/L 劑量進行后續實驗。

圖5 姜黃素對293T細胞活性的影響（n=3）Fig.5 Effect of curcumin on cell viability of 293T（n=3）

2.4 雙熒光素酶活性的檢測

2.4.1 pFireRluc-CCR5 雙熒光素酶報告基因表達載體活性驗證 沒有轉染pFireRluc-CCR5 重組質粒的對照組（Control）與pFireRluc-CCR5轉染組相比差異有統計學意義（P<0.05），實驗結果如圖6 所示，說明pFireRluc-CCR5 重組質粒轉染成功，且所構建載體具有活性。

圖6 pFireRluc-CCR5轉染對熒光素酶表達的影響Fig.6 Effect of pFireRluc-CCR5 transfection on lucifer?ase expression

2.4.2 姜黃素對CCR5 啟動子活性的影響 為了進一步檢驗姜黃素對CCR5 啟動子活性的影響，將轉染pFireRluc-CCR5 重組載體的293T 細胞，給予不同濃度的姜黃素處理24 h，測定各組熒光強度。實驗結果如圖7所示，與0 μmol/L姜黃素處理組相比，無水乙醇對照組熒光強度無顯著變化，說明姜黃素溶劑無水乙醇對CCR5 啟動子活性無明顯影響（P=0.9956）。且隨著姜黃素濃度的升高，CCR5啟動子活性顯著降低推測姜黃素對CCR5 啟動子活性具有抑制作用。

圖7 姜黃素對熒光素酶表達的影響Fig.7 Effect of curcumin on expression of luciferase

3 討論

HIV變異極其迅速，難以制備特異性疫苗，而現有抗HIV 藥物普遍存在毒副作用較大和易產生耐藥的問題[9］。目前艾滋病仍然是一項全球主要公共衛生問題[10-11］。趨化性細胞因子受體CCR5 作為嗜巨噬細胞性HIV-1 病毒的輔助受體，近年來備受關注。因此，以CCR5 為靶點，阻斷HIV-1 早期感染，為防治艾滋病帶來了新希望。

姜黃的主要生物活性成分姜黃素，已被證明具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗細菌、抗真菌、抗原蟲、抗病毒等作用[12-14］。本研究發現：姜黃素能夠顯著降低趨化性細胞因子CCR5 啟動子活性。推測姜黃素可能通過抑制CCR5 啟動子活性下調細胞表面CCR5 蛋白表達來影響HIV-1 侵入人體。為了進一步驗證姜黃素對CCR5 的作用機制，將海腎熒光素酶報告基因Rluc和CCR5啟動子基因重組入含有Firely 熒光素酶報告基因的pGL4.10 表達載體上，構建了重組載體pFireRluc-CCR5，能夠同時表達Firely和Rluc，并以Rluc 作為內對照，降低了本底的影響，提高了轉染效率。將該雙報告載體轉染入293T 細胞，能夠較真實反映出CCR5 啟動子活性。空細胞對照組與轉染重組載體pFireRluc-CCR5 組的雙熒光酶報告實驗結果顯示：pFireRluc-CCR5 重組載體轉染成功且所構建載體具有活性。通過用不同濃度的姜黃素對轉染pFireRluc-CCR5 的細胞進行干預，雙熒光酶報告基因實驗結果顯示：隨著姜黃素濃度的增加，CCR5 啟動子活性顯著下調，提示姜黃素對CCR5 啟動子具有抑制作用，且具有劑量依賴性。因此推測，姜黃素可能通過抑制CCR5 活性，減少細胞表面CCR5的表達從而影響HIV-1侵入人體。

綜上，姜黃素可能通過抑制CCR5 活性從而影響HIV-1 侵入人體，姜黃素影響HIV-1 感染輔助受體CCR5 的直接作用機制，還需要進一步深入研究，也是本課題組下一步準備進行的研究內容，所獲得的研究成果有望提升現有抗艾滋病治療的效果，對減少抗病毒藥物的使用及長期服藥的毒副作用以及降低經濟負擔等具有重要意義。同時，pFireRluc-CCR5 雙熒光素酶報告基因表達載體的成功構建，也為針對CCR5 靶點活性抑制劑的篩選奠定了基礎。