lncRNA12753在β-葡聚糖誘導小鼠樹突狀細胞成熟中的作用①

蘇明明 沈 凱 丁 駿 寧永玲 戚春建

（南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院中心實驗室，腫瘤研究所，常州213164）

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是體內最重要的專職抗原提呈細胞，在啟動和調節先天免疫和適應性免疫應答中起關鍵作用[1-2］。腫瘤組織浸潤DC可以捕獲并加工腫瘤抗原，在趨化因子的作用下，遷移至外周淋巴器官激活初始CD4+和CD8+T 細胞以啟動特異性細胞免疫應答。此外，DC還可以分泌多種趨化因子和細胞因子來介導其他免疫細胞募集到免疫反應發生部位，例如IL-8、MIP、IL-6 和IL-12 等[3-4］。因此，DC 在抗腫瘤免疫中具有不可或缺的作用[5-6］。目前，基于DC 的腫瘤疫苗在全球范圍內已廣泛應用于臨床試驗和治療[7］。本課題組的臨床研究結果也顯示，負載自體腫瘤抗原的DC 疫苗可以在58% 的Ⅱ/ⅢA 期ER/PR 雙陰性乳腺癌患者體內誘導產生腫瘤特異性的遲發型超敏反應，延長患者的無進展生存期[8］。

DC 通過模式識別受體（pattern recognition re‐ceptors，PRR）如Dectin-1、TLR-4 等識別病原體及細胞內容物等抗原信息后啟動分化、成熟，其成熟程度與免疫微環境中的信號刺激密切相關[9］。在DC的發育成熟過程中，細胞表面分子表達、細胞因子分泌和抗原加工能力都會發生顯著變化。β-葡聚糖是一種由D-葡萄糖單體通過β-糖苷鍵連接形成的多糖，存在于多種植物和微生物中。作為生物效應調節劑，β-葡聚糖的抗腫瘤和抗感染活性已得到廣泛研究[10-11］。研究表明，DC 表面的Dectin-1 分子可以識別β-葡聚糖，并通過形成免疫突觸激活下游信號引發DC 免疫功能改變。本課題組前期的研究表明，β-葡聚糖可以直接誘導DC 成熟，驅使CD4+T 細胞向Th1 分化，促進細胞毒T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）增殖，其下游信號與ERK、P38 等信號通路相關[12］。早在2009 年，LIU 等[13］用新鮮分離的小鼠腫瘤細胞與DC 共培養，誘導其分化為腫瘤微環境馴化DC（TEDC），抑制CD4+T 細胞的增殖，從而提高腫瘤的免疫逃逸，本課題組前期的研究表明β-葡聚糖可以促進TEDC 成熟且抑制T 細胞分化[14］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200 nt且不具有蛋白質編碼能力的RNA。lncRNA 可以調控多種細胞的發育和分化，比如心肌細胞、干細胞、上皮細胞、紅細胞、脂肪細胞和多種不同免疫細胞譜系等，與主要依賴堿基互補性調控靶基因表達的miRNA 不同，lncRNA 涉及多種機制來調節這些生物學過程[15］。其中大多數功能需要與一種或多種RNA 結合蛋白（RNA binding protein，RBP）相互作用來實現[16-17］。本研究發現β-葡聚糖激發成熟的DC 會顯著上調表達lncRNA-12753。因此，本研究探索了lncRNA12753 在β-葡聚糖誘導DC成熟過程中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 本研究使用的β-葡聚糖是一種源于酵母細胞壁的全葡聚糖顆粒（whole particle glu‐can，WGP），購自南京英繆賽生物科技有限公司。為了去除β-葡聚糖中可能的LPS 污染，預先使用200 mmol/L NaOH 處理20 min，徹底洗滌后，重懸于去離子水中。C57BL/6小鼠購自常州市卡文斯實驗動物有限公司。CD4 卵清蛋白T 細胞受體轉基因OT-Ⅱ小鼠由清華大學祁海教授慷慨惠贈，所有小鼠在無特定病原體的條件下飼養。

1.1.2 實驗試劑 重組小鼠FMS 樣酪氨酸激酶3配體（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt3L）購自Peprotech 公司；檢測IL-12p40、IL-10、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的ELISA 試劑盒，PE 標記的抗小鼠CD11c 抗體，FITC 標記的抗小鼠I-A/I-E（MHC Ⅱ）抗體，Per‐CP-cy5.5 標記的抗小鼠CD86 抗體，FITC 標記的抗小鼠CD40 抗體，PerCP-Cy5.5 標記的抗小鼠CD80抗體，羧基熒光黃二乙酸鹽琥珀酰亞胺（carboxyfluo‐rescin succinimidyl ester，CFSE），PE 標記的抗小鼠CD4 抗體、PE-cy7 標記的抗小鼠IFN-γ 抗體以及胞內染色固定劑、破膜劑均購自Biolegend 公司；白細胞活化混合物（leukocyte activation cocktail，LAC）購自BD Pharmingen 公司；RPMI1640 培養基、減血清培養基（Opti-MEM）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購自Gibco 公司；胎牛血清（FBS）購自BI 公司；TRIzol 試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green Supermix 購自Va‐zyme 公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購自Sigma-Aldrich 公 司；CD4 磁 珠 分 選 試 劑 盒、Lipofectami‐neTM2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓DC 培養 取6～8 周齡C57BL/6小鼠，CO2法處死后取其股骨和脛骨，剔除肌肉，用PBS 反復吹洗骨髓腔得到骨髓細胞。離心后，加入4 ml 紅細胞裂解液去除紅細胞，最后用70 μm 細胞篩過濾。使用RPMI1640 完全培養基（含100 ng/ml Flt3L、100 ml/L FBS、0.009 mmol/L β-巰基乙醇、10 mmol/L 丙酮酸鈉和1 mmol/L 非必需氨基酸）按細胞數1×106個/ml 重懸細胞，再按每孔3 ml 鋪至6 孔細胞培養板中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。第3 天進行半換液，第5 天收集細胞，為未成熟DC。加入100 μg/ml β-葡聚糖繼續培養2 d 誘導成熟，未刺激組設為對照。

1.2.2 測序分析 使用3種不同生長環境（正常培養基、正常培養基中加入小鼠肺癌細胞株LLC 或小鼠乳腺癌細胞株4T1 培養上清液）得到未成熟DC（N、LLC 或4T1），3 組未成熟DC 分別經WGP 誘導后得到成熟DC（mN、mLLC 或m4T1）。各組收集至少5×106個細胞，預冷PBS 洗滌后，用TRIzol 處理保存送至測序公司進行轉錄組測序。

1.2.3 siRNA 轉染 第3 天半換液時進行siRNA轉染（LipofectamineTM2000 終濃度為2 μg/ml、siRNA終濃度為0.528 μg/ml）。干擾處理48 h 后，收集細胞。lncRNA12753-siRNA 序列：F：5'-GCAAAUCAU‐UUCAGCCCAATT-3'，R：5'-UUGGGCUGAAAUGAU‐UUGCTT-3'；陰性對照（NC）序列：F：5'-UUCUCC‐GAACGUGUCACGUTT-3'，R：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 用TRIzol試劑處理細胞并提取RNA，逆轉錄合成cDNA。qRT-PCR 20 μl 反應體系包括上下游引物各1 μl、cDNA 模 板2 μl、2×SYBR Green Supermix 10 μl、ddH2O 6 μl。每組樣品設3 個復孔，經過40 個循環擴增后以GAPDH 為內參計算lncRNA 組間的相對表達量，計算公式為2?ΔΔCt。GAPDH 引物序列：F：5'-CACUCAAGAUUGUCAGCAATT-3'，R：5'-UUGCUGACAAUCUUGAGUGAG-3'；lncRNA12753引物序列：F：5'-TCCTCACCTCACCGAAGCC-3'，R：5'-CAGC‐GTTGGATAAGTACCTCACA-3'。

1.2.5 流式細胞術 收集細胞，預冷PBS 洗滌后，與熒光染料標記的抗CD11c、CD40、CD80、CD86、MHC Ⅱ單克隆抗體和同型對照抗體4℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次后，用流式細胞儀進行分析。

1.2.6 酶聯免疫吸附實驗（ELISA） 收集各組培養上清液，置于?80℃以備用。按照ELISA 試劑盒的操作說明，進行包被、一抗孵育、二抗孵育、顯色等，最后用酶標儀測定標準品濃度和吸光度（A）值并繪制標準曲線，計算上清液中TNF-α、IL-12p40、IL-6、IL-10和IFN-γ的濃度。

1.2.7 T 細胞增殖分化試驗 取6～8 周齡OT-Ⅱ小鼠脾臟和淋巴結，制備成單細胞懸液。裂解紅細胞后使用磁珠分選出CD4+T 細胞，并進行CFSE 標記。將T 細胞和各組DC 按照5∶1 的比例混合培養，同時加入100 μg/ml OVA 作為抗原。培養3～5 d后，加入LAC 處理4～6 h 收集細胞，表面染色后再固定破膜，進行胞內染色，最后使用流式細胞儀分析CD4+T細胞增殖和分化情況。

1.3 統計學分析 應用Graphpad Prism7.0 軟件繪制熱圖、柱狀圖，Flowjo 7.60 軟件分析流式數據，String 數據庫進行蛋白質相互作用分析。所有數據使用表示，兩兩組間比較使用t檢驗，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 成熟DC 差異表達lncRNA 的篩選 與未成熟DC 相比，3 種不同生長環境下的DC 經WGP 誘導成熟后（mN vs N、mLLC vs LLC、m4T1 vs 4T1），差異性表達且變化趨勢一致的lncRNA 有9 個，上調4 個，下調5 個（圖1A）。qRT-PCR 進一步進行驗證，各基因表達變化和測序結果一致。 其中發現Lnc-TCONS_00012753 的差異表達最顯著，與未成熟DC相比，成熟DC 中上調為7.8 倍（圖1B），因此本文選擇lncRNA12753 作為實驗研究對象。 對lnc-RNA12753 設計了3 條siRNA 序列，分別干擾后，使用qRT-PCR 檢測評估干擾效率。 結果顯示siR‐NA5655 干擾效率最高，可以降低30%～44% 的lnc-RNA12753 的表達（圖1C），且差異具有統計學意義（t=5.201，P<0.05）。

圖1 β-葡聚糖誘導成熟的DC中差異表達lncRNA的篩選Fig.1 Screening of differentially expressed lncRNA in ma?ture DC stimulated by β-glucan

2.2 lncRNA12753 對WGP 誘導DC 表型的影響

未成熟DC 經lncRNA12753 敲低后，再加入WGP 誘導，48 h 后檢測DC 表面分子的變化。結果表明，與對照組相比，干擾組DC 表面MHC Ⅱ表達水平顯著降低，對照組MFI 值為358.8±68.13，干擾組MFI 值為248.2±47.42，差異具有統計學意義（P<0.05）。同時還檢測了共刺激分子CD86、CD80、CD40 等分子的表達情況，發現兩組間表達一致（圖2）。

圖2 敲低lncRNA12753 對β-葡聚糖激發DC 表面分子表達的影響Fig.2 Effect of knocking down lncRNA12753 on mole?cules expression on DCs surface stimulated by β -glucan

2.3 lncRNA12753 對WGP 誘導DC 產生炎癥細胞因子的影響 收集上清液并檢測TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10 的濃度情況。使用WGP 分別激發干擾組和對照組DC后，實驗結果表明，DC中lncRNA12753敲低后，細胞上清液中IL-12p40 的分泌明顯減少，對照 組 為（235.7±38.72）pg/ml，干 擾 組 為（161.3±23.91）pg/ml，差異有統計學意義。而IL-10 的水平顯著提高，對照組為（43.11±3.829）pg/ml，干擾組為（277.9±10.67）pg/ml，差異有統計學意義（圖3）。IL-6、TNF-α也呈降低趨勢，但差異無統計學意義。

圖3 敲低lncRNA12753 對β-葡聚糖激發DC 分泌細胞因子的影響Fig.3 Effect of knocking down lncRNA12753 on cyto?kines secretion of DCs stimulated by β-glucan

2.4 lncRNA12753 對WGP 誘 導DC 激 發T 細 胞 免疫應答的影響 使用OT-Ⅱ小鼠來源的CD4+T 細胞來測定DC誘導抗原特異性T細胞免疫應答的能力。增殖實驗結果表明，DC中下調lncRNA12753的表達后，其誘導OVA 特異性CD4+T 細胞增殖的能力顯著降低，為對照組的35%。進一步分析這些增殖的T細胞中IFN-γ+Th1 細胞的比例，發現干擾組僅為對照組的50%。同時，收集DC-T細胞共培養上清液并檢測IFN-γ 的分泌水平，發現對照組為（4.173±0.6308）pg/ml，而實驗組為（2.027±0.4969）pg/ml，差異有統計學意義（圖4）。

圖4 敲低lncRNA12753 削弱β-葡聚糖激發DC 誘導抗原特異性Th1細胞免疫應答的能力Fig.4 Knocking down lncRNA12753 impaired β -glucanstimulated DCs functions to elicit antigen specific Th1 cells immune responses

2.5 String 數據庫分析蛋白質之間的相互作用根據上述實驗結果，用JASPAR 數據庫聯合UCSC數據庫預測了調控MHC Ⅱ和炎癥細胞因子（IL-6、IL-10、IL-12p40、TNF-α）表達的轉錄因子，發現轉錄因子RBPJ、IRF7、KLF14 對上述分子的表達都有調控作用。 進一步對lncRNA12753 進行分析，通過BLAST 序列比對得出lncRNA12753 的靶基因為Timp3 和Syn3，將靶基因（Timp3、Syn3），MHC Ⅱ（Ciita），炎癥細胞因子（IL-12p40、IL-10、IL-6、TNF-α）和篩選的轉錄因子（RBPJ、IRF7、KLF14）輸入到String 數據庫得到蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）。根據目前數據庫中已有信息，lncRNA12753暫時沒有發現直接調控DC 中MHC Ⅱ、IL-12p40 和IL-10，但其靶基因Timp3 和上述炎癥細胞因子及轉錄因子IRF7 存在著聯系（圖5A）。后續qRT-PCR 實驗表明敲低lncRNA12753后，轉錄因子IRF7發生顯著性下降，差異具有統計學意義，說明lncRNA12753和IRF7的確存在著某種調控關系，但具體調控機制等待進一步實驗（圖5B）。

圖5 String數據庫分析蛋白質之間的相互作用（PPI）Fig.5 String database analysis of protein-protein interac?tion（PPI）

3 討論

lncRNA 是免疫系統中基因表達調控的關鍵因素之一，具有高度譜系特異性，調節先天和適應性免疫細胞的分化及其功能[18-19］。Lnc-DC 是DC 中一組特定的長鏈非編碼RNA，WANG 等[20］曾報道下調DC 中lncRNA 表達后，單核細胞和小鼠骨髓細胞分化為DC的數量顯著減少，且其刺激T細胞活化的能力也降低，它通過與STAT3的C末端相互作用，阻止SHP1 對STAT3 的去磷酸化，進而促進STAT3 信號傳導。ZHUANG 等[21］進一步研究表明Lnc-DC 還會通過TLR9/STAT3信號通路調控DC的生長、凋亡和免疫應答。在上述研究中，激發DC 成熟使用的誘導物為LPS。為探索lncRNA 在β-葡聚糖誘導DC 成熟及其免疫功能發揮中的作用，本研究使用了不同生長環境（正常和腫瘤微環境）下誘導產生的DC，經β-葡聚糖激發后，進行轉錄組測序，篩選出了顯著上調表達的lncRNA12753。

為了明確lncRNA12753 對DC 免疫功能的影響，本研究使用siRNA技術對DC中lncRAN12753進行了敲低表達，再分析其免疫狀態的變化。實驗結果表明，敲低lncRNA12753 表達后，DC 表面的MHCⅡ明顯下調。同時，這種DC 對細胞因子IL-12p40的分泌降低，而IL-10 分泌增加。成熟DC 激活T 細胞免疫應答需要三種信號，第一信號是MHC分子與抗原肽結合形成的復合物，將抗原信息傳遞給T 細胞表面受體；第二信號是DC 表面的共刺激分子CD86、CD80 和CD40 等與T 細胞表面分子如CD28等相互作用后產生共刺激信號；第三信號是DC 分泌產生的細胞因子如IL-12、TNF-α、IL-10等，直接影響T 細胞的極化方向[22-24］。其中IL-12誘導T 細胞向Th1 分化，而IL-10 誘導細胞向Th2 分化。本實驗結果提示，lncRNA12753 可能會影響DC 誘導T 細胞增殖和分化的能力。接下來，將DC 與OT-Ⅱ小鼠CD4+T 細胞進行共培養，證實了lncRNA12753 的表達下調確實會削弱DC 誘導OVA 抗原特異性CD4+T細胞增殖和向Th1細胞分化的能力。

由String 數據庫得出的結果顯示干擾素調節因子7（IRF7）是最有可能參與調控的轉錄因子，IRF7最初是在EB 病毒感染中發現的，后來成為Ⅰ型干擾素（IFNs）抗病原感染的關鍵調節因子，它通過觸發病原體識別受體（PRRs）識別病原核酸的信號級聯來激活IRF7[25］。漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）表達IRF7，并能夠在離體TLR-9 刺激下迅速產生Ⅰ型IFN 和IL-12p40[26］。此 外，IRF7 的 激 活 也 可 增 加MHC Ⅱ、共刺激分子的表達以及IFN-α 和TNF-α 的產生[27］，但具體調控機制尚需進一步實驗驗證，這也是本課題組目前正在進行的工作。

總之，本研究表明，lncRNA12753 通過調節DC表面MHC Ⅱ的表達及IL-12、IL-10 極化因子的分化，影響其誘導Th1細胞免疫應答的能力，具體分子機制尚待進一步研究。