蔗糖為原料同步糖化發酵生產乳酸單體

張樺宇，田康明，趙繼華，牛丹丹，MCHUNU Nokuthula Peace，王正祥,*

(1天津科技大學生物工程學院，天津300457；2天津科技大學化工與材料學院，天津300457；3Biotechnology Platform, Agricultural Research Council, Pretoria South Africa 0001)

0 引言

甘蔗是世界上生物量最大的栽培作物，是蔗糖生產的主要來源，也是我國重要的經濟農作物[1]。蔗糖作為甘蔗的主要產物，一直以來都是我國重要的生活物資和戰略儲備物資。隨著社會進步與我國淀粉糖產業的迅猛發展，近年來蔗糖消費結構與蔗糖作為工業原料的應用領域出現了重大改變。需要拓寬以蔗糖為大宗工業原料規模化生產其他大宗工業品的生產技術。現有以蔗糖或糖蜜生產活性干酵母和燃料乙醇，可以將蔗糖就地實現大規模生物轉化，但是經濟效益有待進一步提高[2-3]。因此，尋求更大規模的、商業價值更顯著的其他大宗工業品或平臺化合物，可以更好地提升甘蔗種植業與甘蔗產業的經濟效益與社會效益。

近年來，隨著“白色污染”治理需求，生物可降解聚乳酸材料發展迎來巨量市場需求。聚乳酸生產所需乳酸單體的大規模工業化生產，已成為聚乳酸產業鏈中最為關鍵的一環[4-6]。前期的研究結果顯示，以淀粉或生物柴油副產物甘油為原料，通過代謝工程菌生物代謝已實現乳酸單體(D-型乳酸或L-型乳酸)的規模化生產[7-9]。

進一步尋找乳酸單體生產的大宗發酵原料(如蔗糖)，同樣是實現乳酸單體生產與聚乳酸產業鏈健康平穩發展的重要內容。已有研究結果表明，郭洋等[10]篩選分離出1株米根霉GY18，能夠利用高濃度的蔗糖(120 g/L)發酵產L-乳酸114.7 g/L，產酸強度為2.39 g/(L·h)，轉化率為95.5%。趙錦芳等[7]利用大腸桿菌HBUT-L，以蔗糖和甘蔗糖蜜發酵產L-乳酸，乳酸濃度為60.0和87.0 g/L，產酸強度分別為0.625和0.389 g/(L·h)，光學純度均達99%，糖酸轉化率分別為74.0%和83.5%。Zhou等[11]以大腸桿菌SZ132利用蔗糖發酵產D-乳酸，乳酸濃度為90 g/L，產酸強度為0.75 g/(L·h)，光學純度高達99.5%，糖酸轉化率為90.0%。Lebaka等[12]利用蔗糖發酵L-乳酸濃度144.2 g/L，產酸強度為3.0 g/(L·h)，糖酸轉化率為96.13%。Calabia等[13]利用甘蔗糖蜜和甘蔗汁，產D-乳酸濃度為107和120 g/L，糖酸轉化率分別為89.9%和90.2%。由于絕大多數大腸桿菌代謝蔗糖的能力缺失或代謝能力較低，以大腸桿菌重組菌從蔗糖合成乳酸單體的發酵強度與產酸水平有待進一步提升。

本課題組在前期的研究中，已創建了系列乳酸單體高效生產菌種，實現了以葡萄糖或甘油為原料的L-乳酸規模化發酵生產[8-9]。為了實現以蔗糖為原料生產L-乳酸的目標，本文在產L-乳酸重組菌JC31L的基礎上[14-15]，試圖建立以蔗糖為原料發酵生產L-乳酸的高效新工藝，以實現蔗糖為原料的乳酸單體的高效生產，也為大宗原料蔗糖轉化為大宗需求量乳酸單體的工業化生產提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株JC31L，為產L-乳酸重組大腸桿菌，為本實驗室前期構建和保藏[14-15]。

1.2 儀器和設備

本研究中所使用的主要儀器和設備具體如表1所示。

表1 主要儀器和設備

1.3 培養基

LB培養基[16]，固體培養基為在LB液體培養基的基礎上添加2%瓊脂。

M9培養基[16]：十二水磷酸氫二鈉15.11 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，氯化銨1 g/L，氯化鈉0.5 g/L，pH為7.0。接種前加入0.1%硫酸鎂溶液(1 mol/L)、0.1%微量元素溶液。葡萄糖、果糖或蔗糖溶液根據需要添加。

1.4 蔗糖酶酶活測定

蔗糖酶的酶活測定，參照GB/T 5009.255-2016中的方法進行[17]。蔗糖酶酶活定義：一個蔗糖酶單位(U)在37℃、pH 6.5條件下，每分鐘水解產生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

1.5 不同碳源生長與產酸評價

采用M9培養基制備固體平板，分別添加5 g/L的葡萄糖、果糖和蔗糖作為唯一碳源，同時添加氨芐青霉素100 μg/mL。重組菌由甘油凍藏管劃線至M9固體平板，37℃培養15 h，觀察菌落生長情況。搖瓶發酵工藝和發酵罐發酵工藝，均采用實驗室前期建立的發酵工藝進行[9]。

1.6 蔗糖酶基礎酶學性質分析

蔗糖酶酶制劑采購于江蘇銳陽生物科技有限公司，酶活單位為70000 U/g。將酶粉用無菌水溶解后，過0.22 μm的微孔濾膜進行除菌，分裝后備用。

1.6.1 熱穩定性

所試蔗糖酶在30～60℃溫度下熱處理1 h，并測定其殘余酶活，以未經保溫處理的酶樣酶活為100%來計算各樣本的相對酶活，確定酶的熱穩定性。

1.6.2 pH穩定性

所試蔗糖酶在pH 3.0～7.5的條件下放置1 h，并測定其殘余酶活，以未經放置1 h處理的酶樣酶活為100%來計算各樣本的相對酶活力，確定酶的pH穩定性。

1.6.3 金屬離子對酶活的影響

所試蔗糖酶在5 mmol/L的不同金屬離子溶液(Mg2+、Zn2+、Ni+、K+、Mn2+、Ca2+、Li+、Na+或Fe2+)于4℃條件下放置16 h后，測定樣本的酶活，以添加等體積緩沖液的酶液酶活為100%來計算各樣本的相對酶活力，確定不同金屬離子對蔗糖酶酶活的影響。

1.7 同步糖化發酵工藝

1.7.1 蔗糖酶添加量的確定

在37℃、pH 7.0和42℃、pH 7.0的發酵工藝條件下測定蔗糖酶的酶活，并與酶活定義條件下(37℃、pH 6.5)蔗糖酶酶活對比。根據酶活定義條件下蔗糖酶對蔗糖的水解和單糖碳源發酵條件下糖的消耗量，確定蔗糖酶的基礎添加量。

1.7.2 同步糖化發酵試驗

采用前期建立的變溫發酵工藝加以改進進行[9]，以蔗糖替代葡萄糖進行補料發酵。

1.8 分析方法

1.8.1 糖分的測定

⑴葡萄糖濃度測定：將樣品適當稀釋后使用SBA-40C型生物傳感儀進行葡萄糖濃度的測定，取3次平行數據的平均值。

⑵果糖濃度測定：用二硝基水楊酸法(DNS)法[18]測定還原糖的濃度，測定值減去其中的葡萄糖濃度即為樣品中果糖的濃度，取3次平行數據的平均值。

⑶蔗糖濃度測定：蔗糖濃度用HPLC方法進行測定[19]。

1.8.2 菌體量測定

菌體量通過分光光度計濁光度法測OD600，然后按照1 OD等于0.38 g/L細胞干重的對應關系進行生物量的換算。

1.8.3 L-乳酸及有機酸的測定

發酵過程采用SBA-40C生物傳感儀酶膜法對L-乳酸濃度進行快速測定。所有數據均為3次平行試驗結果的平均值。同時采用HPLC對樣本中L-乳酸及其他有機酸的準確含量進行測定，色譜檢測條件為：色譜柱為HPX-87H有機酸分析柱，柱溫為65℃，檢測波長為210 nm，流動相為5 mmol/L濃度的硫酸溶液，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL。

1.8.4 L-乳酸光學純度的測定

采用HPLC進行，色譜檢測條件為：色譜柱為Astec CLC-L光學純度分析柱，柱溫為25℃，檢測波長為254 nm，流動相為5 mmol/L濃度的硫酸銅溶液，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。

2 結果與討論

2.1 乳酸生產菌的碳源代謝能力

將菌株JC31L分別劃線于以5 g/L濃度的葡萄糖、果糖、蔗糖為唯一碳源的M9固體培養基上，37℃培養15 h，觀察菌體生長情況，同步分別以葡萄糖、果糖、蔗糖為唯一碳源進行搖瓶發酵，分別測定生物量L-乳酸濃度，結果如圖1所示。菌株JC31L在蔗糖為唯一碳源處未長出菌落，而在葡萄糖、果糖碳源處表現出較好的生長特征；在液體培養條件下，菌株同樣可以利用葡萄糖或果糖為碳源進行生長、發酵，但不能以蔗糖為碳源進行生長、發酵。可見，L-乳酸生產菌株JC31L不具有直接利用蔗糖的能力。此菌株能夠很好代謝葡萄糖和果糖，也從另外一個方面說明，蔗糖被水解為葡萄糖和果糖后，可以作為此菌株的碳源。

圖1 出發菌JC31L利用不同碳源的生長和產酸情況

2.2 代謝單糖和轉化糖為L-乳酸

在5 L發酵罐中，分別以葡萄糖、果糖和蔗糖酶解后的轉化糖為碳源進行產L-乳酸發酵，結果如圖2和表2所示。菌株JC31L能高效利用葡萄糖或果糖進行L-乳酸發酵生產；以轉化糖為碳源進行發酵生產時，葡萄糖和果糖代謝存在葡萄糖效應，葡 萄糖代謝優先于果糖代謝，當葡萄糖濃度低于10 g/L時葡萄糖效應消除，果糖代謝效率明顯恢復。可見，優化轉化糖的生成方式和補加方式，可以實現菌株JC31L從蔗糖直接高效合成乳酸單體。由于蔗糖可以用蔗糖酶快捷水解為轉化糖，為此，我們需要進一步探討蔗糖酶的應用生化屬性。

圖2 5 L發酵罐中出發菌JC31L利用不同碳源生產L-乳酸

表2 不同碳源L-乳酸發酵差異

2.3 蔗糖酶在模擬發酵生產條件下的酶學特征

2.3.1 熱穩定性

在pH 6.5的條件下，將蔗糖酶酶液在不同溫度下保溫1 h，取樣測定殘余酶活，得到蔗糖酶的溫度穩定性曲線，結果如圖3所示。蔗糖酶在37～55℃范圍內比較穩定。蔗糖酶在37℃下，熱穩定性為93%；蔗糖酶在42℃下，熱穩定性為95%。可見，其熱穩定性適用于發酵過程的蔗糖水解。

圖3 蔗糖酶在不同溫度下的熱穩定性

2.3.2 pH穩定性

在37℃條件下，將蔗糖酶酶液在不同pH緩沖液中室溫下放置1 h，取樣測定殘余酶活，得到蔗糖酶的pH穩定性曲線，結果如圖4所示。蔗糖酶在 pH 5.0～7.0范圍內比較穩定。蔗糖酶在pH 6.5下，穩定性為96%；蔗糖酶在pH 7.0下，穩定性為90%。可見，此蔗糖酶的作用pH與發酵工藝pH要求吻合。

圖4 蔗糖酶在不同pH下的穩定性

2.3.3 金屬離子對酶活力的影響

不同金屬離子對酶活的影響結果如圖5所示。所測試的9種金屬離子在5 mmol/L濃度下對蔗糖酶的酶活力作用不同，Mg2+、K+和Ca2+對蔗糖酶酶活力無明顯作用，Zn2+、Ni+以及Mn2+對蔗糖酶酶活力有微弱抑制作用，Fe2+對蔗糖酶酶活力有明顯抑制作用，Li+和Na+對蔗糖酶酶活力有明顯促進作用。發酵培養基中所含的金屬離子為K+和Na+，厭氧階段用Ca(OH)2來維持發酵pH，可見，發酵中培養基的成分和pH調節劑對蔗糖酶的酶活力沒有抑制作用。

2.4 同步糖化發酵合成L-乳酸工藝的建立與優化

由單糖發酵數據可知，在5 L發酵罐中進行乳酸發酵，好氧生長階段菌株消耗75 g糖所需的時間為8 h，厭氧產酸階段菌株消耗500 g糖所需的時間為26 h。因此，根據酶活定義選擇好氧階段蔗糖酶的基礎添加量為500 U，選擇厭氧階段蔗糖酶的基礎添加量為1000 U。

在5 L發酵罐中，考察了蔗糖為碳源同步糖化發酵生產L-乳酸的情況，結果如圖6所示。細胞增殖階段，蔗糖水解速率為8.8 g/h，菌體生長9 h后 生物量達到9.2 g/L，菌體生長速率為1.02 g/(L·h)；發酵產酸階段，蔗糖平均水解速率為18.8 g/h，發酵產酸27.5 h后，L-乳酸的平均生成速率為4.95 g/(L·h)，L-乳酸積累量為136 g/L，糖酸轉化率為95.2%。在整個發酵過程中可以看到，葡萄糖始終處于極低水平，蔗糖酶添加量不足應該是引起這種現象的主因，連帶也影響了菌體的生長和產酸速率。

圖6 菌株JC31L以蔗糖為碳源在蔗糖酶存在下的L-乳酸生產

依據上述發酵數據進行計算與分析得出，菌體生長階段蔗糖酶添加量為750 U，發酵產酸階段蔗糖酶添加量為1500 U。以此添加量在發酵過程中添加蔗糖酶，進行上述相似的發酵試驗，結果如圖7所示。菌株生長階段，蔗糖水解速率達到12.5 g/h，菌株生長速率為1.19 g/(L·h)；發酵產酸階段，蔗糖平均水解速率為27.7 g/h，L-乳酸的平均生成速率為5.38 g/(L·h)，L-乳酸積累量達到140 g/L，糖酸轉化率為98%。利用同步糖化發酵技術，避免了高濃度葡萄糖存在時菌株對果糖代謝的影響，L-乳酸的合成速率比以蔗糖為碳源先糖化后發酵工藝提高了17.47%，顯著優于已有報道[10,20]。

圖7 菌株JC31L以蔗糖為原料同步糖化發酵生產L-乳酸

3 結論

本文建立并優化了以蔗糖為原料同步糖化發酵生產L-乳酸的工藝，在此工藝下，L-乳酸的平均產酸速率為5.38 g/(L·h)，厭氧產酸階段的糖酸轉化率為98%，L-乳酸的積累量為140 g/L，成功實現了蔗糖到聚合級L-乳酸的高效轉化。菌株利用同步糖化發酵技術避免了高濃度葡萄糖存在時菌株對果糖代謝的影響，L-乳酸的合成速率比以蔗糖為碳源先糖化后發酵技術提高了17.47%。

本研究不僅為大宗原料蔗糖轉化為大宗需求量乳酸單體的工業化生產提供了重要參考，也為以蔗糖為主要成分的碳源(甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜菜)為原料進行聚合級L-乳酸的工業化生產奠定了基礎。這將有助于后續優化蔗糖產業的結構與豐富聚合級乳酸單體生物制造的原料多樣性。