蔗糖為原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸單體

張樺宇，田康明，趙繼華，牛丹丹，MCHUNU Nokuthula Peace，王正祥,*

(1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津300457；3Biotechnology Platform, Agricultural Research Council, Pretoria South Africa 0001)

0 引言

甘蔗是世界上生物量最大的栽培作物，是蔗糖生產(chǎn)的主要來源，也是我國重要的經(jīng)濟農(nóng)作物[1]。蔗糖作為甘蔗的主要產(chǎn)物，一直以來都是我國重要的生活物資和戰(zhàn)略儲備物資。隨著社會進步與我國淀粉糖產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，近年來蔗糖消費結(jié)構(gòu)與蔗糖作為工業(yè)原料的應(yīng)用領(lǐng)域出現(xiàn)了重大改變。需要拓寬以蔗糖為大宗工業(yè)原料規(guī)模化生產(chǎn)其他大宗工業(yè)品的生產(chǎn)技術(shù)。現(xiàn)有以蔗糖或糖蜜生產(chǎn)活性干酵母和燃料乙醇，可以將蔗糖就地實現(xiàn)大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化，但是經(jīng)濟效益有待進一步提高[2-3]。因此，尋求更大規(guī)模的、商業(yè)價值更顯著的其他大宗工業(yè)品或平臺化合物，可以更好地提升甘蔗種植業(yè)與甘蔗產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益與社會效益。

近年來，隨著“白色污染”治理需求，生物可降解聚乳酸材料發(fā)展迎來巨量市場需求。聚乳酸生產(chǎn)所需乳酸單體的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，已成為聚乳酸產(chǎn)業(yè)鏈中最為關(guān)鍵的一環(huán)[4-6]。前期的研究結(jié)果顯示，以淀粉或生物柴油副產(chǎn)物甘油為原料，通過代謝工程菌生物代謝已實現(xiàn)乳酸單體(D-型乳酸或L-型乳酸)的規(guī)模化生產(chǎn)[7-9]。

進一步尋找乳酸單體生產(chǎn)的大宗發(fā)酵原料(如蔗糖)，同樣是實現(xiàn)乳酸單體生產(chǎn)與聚乳酸產(chǎn)業(yè)鏈健康平穩(wěn)發(fā)展的重要內(nèi)容。已有研究結(jié)果表明，郭洋等[10]篩選分離出1株米根霉GY18，能夠利用高濃度的蔗糖(120 g/L)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸114.7 g/L，產(chǎn)酸強度為2.39 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為95.5%。趙錦芳等[7]利用大腸桿菌HBUT-L，以蔗糖和甘蔗糖蜜發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸，乳酸濃度為60.0和87.0 g/L，產(chǎn)酸強度分別為0.625和0.389 g/(L·h)，光學(xué)純度均達99%，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為74.0%和83.5%。Zhou等[11]以大腸桿菌SZ132利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，乳酸濃度為90 g/L，產(chǎn)酸強度為0.75 g/(L·h)，光學(xué)純度高達99.5%，糖酸轉(zhuǎn)化率為90.0%。Lebaka等[12]利用蔗糖發(fā)酵L-乳酸濃度144.2 g/L，產(chǎn)酸強度為3.0 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率為96.13%。Calabia等[13]利用甘蔗糖蜜和甘蔗汁，產(chǎn)D-乳酸濃度為107和120 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為89.9%和90.2%。由于絕大多數(shù)大腸桿菌代謝蔗糖的能力缺失或代謝能力較低，以大腸桿菌重組菌從蔗糖合成乳酸單體的發(fā)酵強度與產(chǎn)酸水平有待進一步提升。

本課題組在前期的研究中，已創(chuàng)建了系列乳酸單體高效生產(chǎn)菌種，實現(xiàn)了以葡萄糖或甘油為原料的L-乳酸規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)[8-9]。為了實現(xiàn)以蔗糖為原料生產(chǎn)L-乳酸的目標，本文在產(chǎn)L-乳酸重組菌JC31L的基礎(chǔ)上[14-15]，試圖建立以蔗糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的高效新工藝，以實現(xiàn)蔗糖為原料的乳酸單體的高效生產(chǎn)，也為大宗原料蔗糖轉(zhuǎn)化為大宗需求量乳酸單體的工業(yè)化生產(chǎn)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株JC31L，為產(chǎn)L-乳酸重組大腸桿菌，為本實驗室前期構(gòu)建和保藏[14-15]。

1.2 儀器和設(shè)備

本研究中所使用的主要儀器和設(shè)備具體如表1所示。

表1 主要儀器和設(shè)備

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基[16]，固體培養(yǎng)基為在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%瓊脂。

M9培養(yǎng)基[16]：十二水磷酸氫二鈉15.11 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，氯化銨1 g/L，氯化鈉0.5 g/L，pH為7.0。接種前加入0.1%硫酸鎂溶液(1 mol/L)、0.1%微量元素溶液。葡萄糖、果糖或蔗糖溶液根據(jù)需要添加。

1.4 蔗糖酶酶活測定

蔗糖酶的酶活測定，參照GB/T 5009.255-2016中的方法進行[17]。蔗糖酶酶活定義：一個蔗糖酶單位(U)在37℃、pH 6.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

1.5 不同碳源生長與產(chǎn)酸評價

采用M9培養(yǎng)基制備固體平板，分別添加5 g/L的葡萄糖、果糖和蔗糖作為唯一碳源，同時添加氨芐青霉素100 μg/mL。重組菌由甘油凍藏管劃線至M9固體平板，37℃培養(yǎng)15 h，觀察菌落生長情況。搖瓶發(fā)酵工藝和發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，均采用實驗室前期建立的發(fā)酵工藝進行[9]。

1.6 蔗糖酶基礎(chǔ)酶學(xué)性質(zhì)分析

蔗糖酶酶制劑采購于江蘇銳陽生物科技有限公司，酶活單位為70000 U/g。將酶粉用無菌水溶解后，過0.22 μm的微孔濾膜進行除菌，分裝后備用。

1.6.1 熱穩(wěn)定性

所試蔗糖酶在30～60℃溫度下熱處理1 h，并測定其殘余酶活，以未經(jīng)保溫處理的酶樣酶活為100%來計算各樣本的相對酶活，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.6.2 pH穩(wěn)定性

所試蔗糖酶在pH 3.0～7.5的條件下放置1 h，并測定其殘余酶活，以未經(jīng)放置1 h處理的酶樣酶活為100%來計算各樣本的相對酶活力，確定酶的pH穩(wěn)定性。

1.6.3 金屬離子對酶活的影響

所試蔗糖酶在5 mmol/L的不同金屬離子溶液(Mg2+、Zn2+、Ni+、K+、Mn2+、Ca2+、Li+、Na+或Fe2+)于4℃條件下放置16 h后，測定樣本的酶活，以添加等體積緩沖液的酶液酶活為100%來計算各樣本的相對酶活力，確定不同金屬離子對蔗糖酶酶活的影響。

1.7 同步糖化發(fā)酵工藝

1.7.1 蔗糖酶添加量的確定

在37℃、pH 7.0和42℃、pH 7.0的發(fā)酵工藝條件下測定蔗糖酶的酶活，并與酶活定義條件下(37℃、pH 6.5)蔗糖酶酶活對比。根據(jù)酶活定義條件下蔗糖酶對蔗糖的水解和單糖碳源發(fā)酵條件下糖的消耗量，確定蔗糖酶的基礎(chǔ)添加量。

1.7.2 同步糖化發(fā)酵試驗

采用前期建立的變溫發(fā)酵工藝加以改進進行[9]，以蔗糖替代葡萄糖進行補料發(fā)酵。

1.8 分析方法

1.8.1 糖分的測定

⑴葡萄糖濃度測定：將樣品適當(dāng)稀釋后使用SBA-40C型生物傳感儀進行葡萄糖濃度的測定，取3次平行數(shù)據(jù)的平均值。

⑵果糖濃度測定：用二硝基水楊酸法(DNS)法[18]測定還原糖的濃度，測定值減去其中的葡萄糖濃度即為樣品中果糖的濃度，取3次平行數(shù)據(jù)的平均值。

⑶蔗糖濃度測定：蔗糖濃度用HPLC方法進行測定[19]。

1.8.2 菌體量測定

菌體量通過分光光度計濁光度法測OD600，然后按照1 OD等于0.38 g/L細胞干重的對應(yīng)關(guān)系進行生物量的換算。

1.8.3 L-乳酸及有機酸的測定

發(fā)酵過程采用SBA-40C生物傳感儀酶膜法對L-乳酸濃度進行快速測定。所有數(shù)據(jù)均為3次平行試驗結(jié)果的平均值。同時采用HPLC對樣本中L-乳酸及其他有機酸的準確含量進行測定，色譜檢測條件為：色譜柱為HPX-87H有機酸分析柱，柱溫為65℃，檢測波長為210 nm，流動相為5 mmol/L濃度的硫酸溶液，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL。

1.8.4 L-乳酸光學(xué)純度的測定

采用HPLC進行，色譜檢測條件為：色譜柱為Astec CLC-L光學(xué)純度分析柱，柱溫為25℃，檢測波長為254 nm，流動相為5 mmol/L濃度的硫酸銅溶液，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸生產(chǎn)菌的碳源代謝能力

將菌株JC31L分別劃線于以5 g/L濃度的葡萄糖、果糖、蔗糖為唯一碳源的M9固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)15 h，觀察菌體生長情況，同步分別以葡萄糖、果糖、蔗糖為唯一碳源進行搖瓶發(fā)酵，分別測定生物量L-乳酸濃度，結(jié)果如圖1所示。菌株JC31L在蔗糖為唯一碳源處未長出菌落，而在葡萄糖、果糖碳源處表現(xiàn)出較好的生長特征；在液體培養(yǎng)條件下，菌株同樣可以利用葡萄糖或果糖為碳源進行生長、發(fā)酵，但不能以蔗糖為碳源進行生長、發(fā)酵。可見，L-乳酸生產(chǎn)菌株JC31L不具有直接利用蔗糖的能力。此菌株能夠很好代謝葡萄糖和果糖，也從另外一個方面說明，蔗糖被水解為葡萄糖和果糖后，可以作為此菌株的碳源。

圖1 出發(fā)菌JC31L利用不同碳源的生長和產(chǎn)酸情況

2.2 代謝單糖和轉(zhuǎn)化糖為L-乳酸

在5 L發(fā)酵罐中，分別以葡萄糖、果糖和蔗糖酶解后的轉(zhuǎn)化糖為碳源進行產(chǎn)L-乳酸發(fā)酵，結(jié)果如圖2和表2所示。菌株JC31L能高效利用葡萄糖或果糖進行L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)；以轉(zhuǎn)化糖為碳源進行發(fā)酵生產(chǎn)時，葡萄糖和果糖代謝存在葡萄糖效應(yīng)，葡 萄糖代謝優(yōu)先于果糖代謝，當(dāng)葡萄糖濃度低于10 g/L時葡萄糖效應(yīng)消除，果糖代謝效率明顯恢復(fù)。可見，優(yōu)化轉(zhuǎn)化糖的生成方式和補加方式，可以實現(xiàn)菌株JC31L從蔗糖直接高效合成乳酸單體。由于蔗糖可以用蔗糖酶快捷水解為轉(zhuǎn)化糖，為此，我們需要進一步探討蔗糖酶的應(yīng)用生化屬性。

圖2 5 L發(fā)酵罐中出發(fā)菌JC31L利用不同碳源生產(chǎn)L-乳酸

表2 不同碳源L-乳酸發(fā)酵差異

2.3 蔗糖酶在模擬發(fā)酵生產(chǎn)條件下的酶學(xué)特征

2.3.1 熱穩(wěn)定性

在pH 6.5的條件下，將蔗糖酶酶液在不同溫度下保溫1 h，取樣測定殘余酶活，得到蔗糖酶的溫度穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖3所示。蔗糖酶在37～55℃范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。蔗糖酶在37℃下，熱穩(wěn)定性為93%；蔗糖酶在42℃下，熱穩(wěn)定性為95%。可見，其熱穩(wěn)定性適用于發(fā)酵過程的蔗糖水解。

圖3 蔗糖酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性

2.3.2 pH穩(wěn)定性

在37℃條件下，將蔗糖酶酶液在不同pH緩沖液中室溫下放置1 h，取樣測定殘余酶活，得到蔗糖酶的pH穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖4所示。蔗糖酶在 pH 5.0～7.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。蔗糖酶在pH 6.5下，穩(wěn)定性為96%；蔗糖酶在pH 7.0下，穩(wěn)定性為90%。可見，此蔗糖酶的作用pH與發(fā)酵工藝pH要求吻合。

圖4 蔗糖酶在不同pH下的穩(wěn)定性

2.3.3 金屬離子對酶活力的影響

不同金屬離子對酶活的影響結(jié)果如圖5所示。所測試的9種金屬離子在5 mmol/L濃度下對蔗糖酶的酶活力作用不同，Mg2+、K+和Ca2+對蔗糖酶酶活力無明顯作用，Zn2+、Ni+以及Mn2+對蔗糖酶酶活力有微弱抑制作用，F(xiàn)e2+對蔗糖酶酶活力有明顯抑制作用，Li+和Na+對蔗糖酶酶活力有明顯促進作用。發(fā)酵培養(yǎng)基中所含的金屬離子為K+和Na+，厭氧階段用Ca(OH)2來維持發(fā)酵pH，可見，發(fā)酵中培養(yǎng)基的成分和pH調(diào)節(jié)劑對蔗糖酶的酶活力沒有抑制作用。

2.4 同步糖化發(fā)酵合成L-乳酸工藝的建立與優(yōu)化

由單糖發(fā)酵數(shù)據(jù)可知，在5 L發(fā)酵罐中進行乳酸發(fā)酵，好氧生長階段菌株消耗75 g糖所需的時間為8 h，厭氧產(chǎn)酸階段菌株消耗500 g糖所需的時間為26 h。因此，根據(jù)酶活定義選擇好氧階段蔗糖酶的基礎(chǔ)添加量為500 U，選擇厭氧階段蔗糖酶的基礎(chǔ)添加量為1000 U。

在5 L發(fā)酵罐中，考察了蔗糖為碳源同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的情況，結(jié)果如圖6所示。細胞增殖階段，蔗糖水解速率為8.8 g/h，菌體生長9 h后 生物量達到9.2 g/L，菌體生長速率為1.02 g/(L·h)；發(fā)酵產(chǎn)酸階段，蔗糖平均水解速率為18.8 g/h，發(fā)酵產(chǎn)酸27.5 h后，L-乳酸的平均生成速率為4.95 g/(L·h)，L-乳酸積累量為136 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為95.2%。在整個發(fā)酵過程中可以看到，葡萄糖始終處于極低水平，蔗糖酶添加量不足應(yīng)該是引起這種現(xiàn)象的主因，連帶也影響了菌體的生長和產(chǎn)酸速率。

圖6 菌株JC31L以蔗糖為碳源在蔗糖酶存在下的L-乳酸生產(chǎn)

依據(jù)上述發(fā)酵數(shù)據(jù)進行計算與分析得出，菌體生長階段蔗糖酶添加量為750 U，發(fā)酵產(chǎn)酸階段蔗糖酶添加量為1500 U。以此添加量在發(fā)酵過程中添加蔗糖酶，進行上述相似的發(fā)酵試驗，結(jié)果如圖7所示。菌株生長階段，蔗糖水解速率達到12.5 g/h，菌株生長速率為1.19 g/(L·h)；發(fā)酵產(chǎn)酸階段，蔗糖平均水解速率為27.7 g/h，L-乳酸的平均生成速率為5.38 g/(L·h)，L-乳酸積累量達到140 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為98%。利用同步糖化發(fā)酵技術(shù)，避免了高濃度葡萄糖存在時菌株對果糖代謝的影響，L-乳酸的合成速率比以蔗糖為碳源先糖化后發(fā)酵工藝提高了17.47%，顯著優(yōu)于已有報道[10,20]。

圖7 菌株JC31L以蔗糖為原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸

3 結(jié)論

本文建立并優(yōu)化了以蔗糖為原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝，在此工藝下，L-乳酸的平均產(chǎn)酸速率為5.38 g/(L·h)，厭氧產(chǎn)酸階段的糖酸轉(zhuǎn)化率為98%，L-乳酸的積累量為140 g/L，成功實現(xiàn)了蔗糖到聚合級L-乳酸的高效轉(zhuǎn)化。菌株利用同步糖化發(fā)酵技術(shù)避免了高濃度葡萄糖存在時菌株對果糖代謝的影響，L-乳酸的合成速率比以蔗糖為碳源先糖化后發(fā)酵技術(shù)提高了17.47%。

本研究不僅為大宗原料蔗糖轉(zhuǎn)化為大宗需求量乳酸單體的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要參考，也為以蔗糖為主要成分的碳源(甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜菜)為原料進行聚合級L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。這將有助于后續(xù)優(yōu)化蔗糖產(chǎn)業(yè)的結(jié)構(gòu)與豐富聚合級乳酸單體生物制造的原料多樣性。