黃龍噴劑對小鼠乳腺癌移植瘤創面愈合的影響*

胡花婷 賴俊耀 李東芳

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，目前發病率居女性惡性腫瘤的第一位，全世界每年約有120多萬女性被診斷為乳腺癌[1,2]，我國乳腺癌發病率和病死率也呈明顯上升趨勢[3]，而其中30%～40% 的患者因發現晚或復發轉移后轉變為晚期乳腺癌。乳腺癌局部未經手術切除或術后局部復發后極易潰破，形成難愈性創面。而這種惡性腫瘤所致的難愈性創面給患者及家庭造成嚴重的經濟負擔和心理壓力。在美國，超過600萬人遭受難愈性傷口，每年的治療費用為250億美元[4]，在歐洲，整個衛生經費的2%用于管理難愈性傷口[5]。惡性腫瘤所致的各種創面問題，是醫療界研究的難點和熱點。乳腺癌發病率高，局部為皮膚淺表腫瘤，難愈性傷口發生率高，腫瘤潰破滲液、惡臭，目前臨床常規選用一些進口敷料(抗感染、促滲液吸收作用)進行對癥處理，療效有限且治療費用高。有研究表明[6]傳統中醫藥治療難愈性創面具有多靶點、多層次、多環節的特點，且劑型多樣，強調整體觀念，辨證論治，具有清熱解毒、活血化瘀、去腐生肌等功效，從而促進創面愈合。

黃龍洗劑為全國名老中醫黎月恒教授的臨床經驗方，經前期臨床觀察具有促進腫瘤術后創面愈合的功效[7]，但是其僅限于臨床觀察，作用機制不清。為更好地開展黃龍洗劑的實驗研究，我們在建立小鼠乳腺癌移植瘤的基礎上，采用黃龍噴劑干預小鼠乳腺癌移植瘤人工創面，進一步探討其是否具有促進乳腺癌創面愈合的效用，初步探討其可能的作用機制，以期尋求一種簡便效廉的治療方法來促進惡性腫瘤所致創面的愈合，減輕患者癥狀和痛苦，具有十分重要的意義和臨床推廣應用前景。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物健康BALB/c小鼠30只，雌性，5～6周齡，體質量18～20 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(湘)2016-0002。每籠5只，SPF屏障系統+層流架飼養，環境適宜、自由進食、飲水，飼料為湖南省腫瘤醫院提供的鼠用顆粒飼料。

1.1.2 實驗藥物黃龍噴劑(生黃芪30 g，龍葵 30 g，苦參 10 g，敗醬草 30 g，生大黃15 g，生附片15 g， 地榆 30 g，紅花 10 g，桃仁 10 g，五倍子 l5 g，白及30 g，連翹10 g)，參考《中藥飲片標準湯劑》[8]，標準湯劑的百分濃度=藥材重量/藥汁收得量×100%，以每克中藥加水約5 ml計算，總水體積的70%加到第一煎中，30%加到第二煎中，濾過，煎好后濾液合并濃縮至所需濃度，并調節中藥復方的pH值到7.4，分裝于150 ml的噴霧器中，4 ℃保存備用，此中藥材出自中醫藥研究所且由湖南省中醫藥研究所統一制備。

1.1.3 主要儀器和試劑ACS電子秤(武漢精宜電子稱重儀器有限公司)；水合氯醛(上海國藥集團生產)；電子顯微鏡(上海無陌光學儀器有限公司)；4T1乳腺癌細胞株(中科院細胞庫)；H-DMEM(美國 GIBCO公司)；胎牛血清及胰蛋白酶(北京索來寶公司)；超凈臺(美國 BIOLOGICAL 公司)；恒溫水浴箱(HH-W420)(江蘇省金壇市醫療儀器廠生產)；CO2恒溫培養箱( TC-2323 型美國 SHEL-DON 公司)；-80 ℃超低溫冰箱(日本 SANYO 公司生產);臺式離心機(Anke TDL-40B)(上海安亭科學儀器廠生產)；細胞培養板(北京天連器材有限公司)；外科手術刀；組織剪；無菌紗布等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及傳代將凍存的乳腺癌4T1細胞復蘇后，于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養、傳代，培養至對數生長期，胰酶消化后用無血清DMEM培養基重懸成5×107/ml細胞懸液。

1.2.2 小鼠乳腺癌移植瘤模型采用細胞懸液法，將配置好的乳腺癌4T1細胞株單細胞懸液，在裸小鼠右側近腋窩第二乳腺脂肪墊深面注射細胞懸液，形成一皮丘，內含0.2 ml細胞懸液(1×107)個，共接種30只，待小鼠移植瘤大小約2 cm時，乳腺癌小鼠移植瘤模型建立成功。

1.2.3 小鼠移植瘤人工創面的建立將建模成功的小鼠采用經典的全層皮膚切割傷模型，在無菌條件下，沿小鼠移植瘤皮膚面，用外科方法作切取全層皮膚，切取2 cm×2 cm的造模面積；建立全層皮膚缺損開放性創面模型；創面加蓋兩層消毒干紗布，醫用膠布固定，造模后每只裸小鼠連續3 d后肢肌肉注射青霉素40萬U預防感染。

1.2.4 分組及給藥方法采用隨機數字表法分組，隨機分為黃龍噴劑組、康復新組、空白對照組，每組10只小鼠。黃龍噴劑組予以黃龍噴劑外噴，每次5 ml，每日2次。康復新組予以康復新溶液外噴，5 ml/次，2次/d。空白對照組不做任何處理。黃龍噴劑組和康復新組均連續外噴藥物10 d。

1.3 觀察指標

1.3.1 小鼠一般情況及創面情況觀察用藥后小鼠的進食狀況，創面有無腫脹、滲出、壞死及出血，創面有無感染發紅，有無新生肉芽組織等。

1.3.2 創面愈合時間創面愈合時間是評價創面愈合的傳統指標之一，是指創面完全上皮化所需的時間，創面上皮化依靠肉眼的觀察，記錄不同時間點創面上皮化的時間。

1.3.3 創面愈合率記錄原始創面面積和未愈合創面面積，按下列公式計算創面愈合率：愈合率= (原始創面面積-未愈合創面面積)/原始創面面積×100%，面積測量方法采用數碼相機拍照行計算機image-pro-plus數碼圖像分析軟件分析創面面積，進行計算。

1.3.4 創面組織病理學檢測取少量創面組織進行病理組織學檢查，觀察創面組織炎性細胞的浸潤，新生血管及新生纖維細胞增生的情況，探討黃龍噴劑促進創面愈合的初步可能機制。

2 結果

2.1 小鼠一般情況及創面情況造模后各組小鼠均出現精神萎靡、進食減少、活動減少等情況，黃龍噴劑組小鼠于用藥后第3天恢復正常，其他2組小鼠活動減少、食少。造模第1天各組小鼠創面均有水腫、滲血。用藥第2天后黃龍噴劑組及康復新組小鼠創面組織周圍水腫、滲血均消失，空白對照組于第3天水腫、滲血消失。用藥3 d后黃龍噴劑組及康復新組創面均有少量滲出，創面無壞死及感染，黃龍噴劑組創面周圍及基底部可見少許肉芽組織顆粒，可見新生上皮由四周向中心生長，空白對照組創面有較多滲出。用藥1周后，黃龍噴劑組創面較前縮小，創面被肉芽組織覆蓋，呈暗紅色，康復新組創面縮小低于黃龍噴劑組，可見少量肉芽組織覆蓋創面周邊，空白對照組創面周邊可見少量肉芽組織，長勢均不及黃龍噴劑組及康復新組。黃龍噴劑組小鼠創面均于10 d前已全部愈合，而康復新組及空白對照組有部分小鼠第10天才愈合，愈合緩慢。

2.2 創面愈合時間黃龍噴劑組創面的平均愈合時間少于空白對照組和康復新組，且差異存在統計學意義(分別為P<0.01和P<0.05)。康復新組創面的平均愈合時間較空白對照組短，差異具有明顯統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 3組小鼠創面愈合時間比較 (只，

2.3 創面愈合率在第3天開始，黃龍噴劑組和康復新組創面愈合率與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；第5天到第10天，黃龍噴劑組創面愈合率與康復新組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠不同時間段創面愈合率比較 (只，

2.4 創面組織病理學檢測病理檢查提示空白對照組創面周邊可見較少肉芽組織，可見較多炎性細胞浸潤，成纖維細胞較少，可見少量新生血管。康復新組可見腫瘤邊緣片狀壞死及出血，可見較多炎性細胞浸潤，成纖維細胞較黃龍噴劑組少，且細胞體較黃龍噴劑組偏小，毛細血管數目及大小不及黃龍噴劑組，黃龍噴劑組成纖維細胞數量較多，體積較大，創面肉芽組織血管豐富，可見散在炎細胞浸潤。見圖1。

圖1 小鼠乳腺癌創面HE染色

3 討論

乳腺癌所致的創面多為乳腺惡性腫瘤細胞浸潤皮膚穿透上皮形成或乳腺癌術后放療后所致，局部表現為紅腫、潰瘍、疼痛等，中醫稱乳腺癌為“乳巖”“乳石癰”，其病因病機為氣機郁滯、正氣虧虛、瘀毒互結，治療當以清熱解毒、活血止痛、生肌斂瘡為主。黃龍噴劑具有清熱解毒、活血止痛、生肌斂瘡的功效，切中乳腺癌的病因病機，臨床使用療效顯著，前期臨床觀察表明黃龍噴劑具有促進直腸癌Mile’s術后局部血液循環，促進肉芽生長，加速傷口愈合的作用[7]，主要由生黃芪、龍葵、苦參、敗醬草、生大黃、生附片、地榆，紅花、桃仁、五倍子、白及、連翹組成。方中黃芪味甘，性溫，入肺、脾二經，具有內托已潰瘡瘍，生肌收口，外固表止汗，腠理充盈之功效，為君藥。龍葵、敗醬草、連翹、生大黃味苦，性寒涼，具有清熱解毒，消癰排膿之功效，共為臣藥。桃仁、紅花活血化瘀，散瘀止痛；白及味苦，性涼，具有收斂止血，消腫生肌之功效；地榆味苦，酸澀性寒，具有涼血止血，解毒斂瘡之功效；苦參清熱燥濕，收濕斂瘡；附片辛甘大熱，補命門衰敗之火，以生脾土，脾土健，則氣血生化有源，共為佐藥。五倍子澀苦微酸，具有收斂創口之功效，為使藥。全方寒熱相宜，燥濕相濟，溫補清消，諸藥合用，共奏清熱解毒、生肌斂瘡、活血化瘀之功。多項研究發現中醫藥可以促進創面肉芽組織生長、調控表皮生長因子的合成和分泌、促進細胞分裂增殖、促進內皮細胞的生長、刺激創面新生血管形成、改善創面的血液循環、調控膠原的合成及代謝、調節創面修復基質形成、營養創面等作用，從而促進創面愈合[9]。但目前對于中醫藥作用于惡性腫瘤所致創面的研究多以臨床觀察為主，實驗研究鮮有報道，大多限于臨床觀察，其促進惡性腫瘤所致創面的機制不清。本研究采用小鼠乳腺癌移植瘤創面模型探討黃龍噴劑干預其創面的作用，結果表明黃龍噴劑相對于康復新組及空白對照組可以減少創面愈合的時間，提高創面愈合率，可能與其減輕炎癥反應，增加膠原纖維的增生，促進毛細血管的生長，改善創面血液循環有關。但本實驗觀察時間較短，未于不同時間點取標本進行病理組織學檢測，不能反映創面愈合改變的病理變化的全過程，且未進行免疫組化，使得實驗數據不夠深入且存在一定的偏差，望在后期實驗中進一步完善。