地塞米松對胎鼠骨骼肌發育相關基因表達的影響

郭田燕，李俊玲，王鶴潔，竇敏敏，李 君，秦 健，杜 榮

（1.山西農業大學動物醫學學院，山西太谷 030801；2.山西農業大學實驗教學中心，山西太谷 030801；3.山西農業大學生命科學學院，山西太谷 030801）

糖皮質激素（Glucocorticoid，GC）對動物機體生命活動有非常重要的作用[1]，主要體現在生理和藥理2 個方面。在生理方面，當機體受到外界環境各種應激刺激（饑餓、寒冷、缺氧等）時，GC 分泌增多，使機體加速代謝來抵抗外界刺激[2]；在藥理方面，臨床上通常會使用糖皮質激素來治療一些疾病，如抗炎癥、抗過敏和調節免疫力等[3-5]。哺乳動物在妊娠期間，來自母體的糖皮質激素可以通過胎盤作用到胎鼠，在胎兒的生長發育過程中發揮重要的作用[6-7]。但如果母體處于應激導致內源性糖皮質激素增加或者長期用藥導致子宮內外源性糖皮質激素含量升高，超過一定限度時會對胎兒的生長發育產生不良影響[8]。其中，骨骼肌是糖皮質激素作用的靶點之一，當體內糖皮質激素水平處于病理劑量時，會導致肌肉發育受阻、質量下降[9]。

Pax3、Pax7 均是Pax（paired box）家族的成員，是肌源性祖細胞的重要調控因子，其中，Pax3 主要激活肌細胞生成因子Myf5 和肌細胞決定因子MyoD，在初級生肌過程中扮演重要角色[10-11]；Pax7 則是維持肌衛星細胞的重要因子[12]，在肌肉的發生和再生過程中發揮著不可或缺的作用[13]。研究表明，肌肉發育負調控因子Myostatin 在胚胎期主要是通過抑制成肌細胞的增殖分化來影響骨骼肌發育，Myostatin可以通過下調肌肉發育正調控的相關基因來影響骨骼肌的生長[14-15]。

本試驗通過建立小鼠母體應激模型，探討母體遭遇糖皮質激素過量時對胎兒骨骼肌發育的影響是否對Myostatin、Pax3 和Pax7 的表達產生影響，并通過生物信息學分析其潛在的調控關系，旨在為進一步深入研究家畜母體應激對子代骨骼肌發育影響的分子調控機制奠定基礎，也為防治動物母體糖皮質激素過度導致的胎兒肌肉發育遲緩提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 供試動物為10 只8 周齡雌鼠、5 只10 周齡雄鼠，質量25～30 g，均購自山西醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和設備 地塞米松針劑和生理鹽水購自同仁大藥房，小鼠糖皮質激素酶聯分析試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司，Trizol 試劑、反轉錄試劑和熒光定量試劑均購自TaKaRa 公司。

生物組織包埋機（益迪醫藥設備廠）、切片機和烤片機（益迪醫藥設備廠）、光學顯微鏡（德國Leica）、熒光定量PCR 儀（美國BIO-RAD）、核酸蛋白測定儀（美國Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養及處理 雌雄鼠分籠飼養于SPF級動物房。試驗處理當日18：00 雌雄2∶1 合籠過夜，并于次日6：30 檢查雌鼠的陰栓，查見陰栓之日定為懷孕第0 天（Embryonic day，E0）。將孕鼠隨機分成2 組：對照組（生理鹽水，0.2 mL/d）、地塞米松處理組（62.5 μg/mL，0.2 mL/d），每組4 只；懷孕第12 天（E12），開始對2 組孕鼠分別進行連續3 d（E12～E14）的相應處理；懷孕第15 天（E15）分別從每組取出孕鼠，采取胎盤內的羊水及胎鼠骨骼肌，分別保存在-20 ℃冰箱和液氮中用于后續試驗。

1.2.2 糖皮質激素（GC）含量的酶聯免疫測定 將收集的羊水離心后取上清液；酶聯免疫試劑盒在室溫下平衡1 h，稀釋標準品，孵育30 min 后洗板；加入酶標試劑孵育30 min 后再次洗板；加入顯色液，避光顯色15 min 后測定OD 值。

1.2.3 胎鼠肌肉組織HE 染色觀察 將胎鼠骨骼肌組織放在Bouin's 固定液中固定24 h，流水沖洗過夜；修整組織塊并依次放入梯度酒精脫水；組織塊經包埋機石蠟包埋，然后進行切片- 展片- 撈片-烤片；將烤干的切片脫蠟并水化，用蘇木精和醇溶性伊紅進行染色，再次脫水后用中性樹膠封片。將切片置于光學顯微鏡下進行觀察。

1.2.4 基因差異表達分析 根據GenBank 收錄的小鼠GAPDH、Myostatin、Pax3、Pax7 基因mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 設計特異性引物，引物序列如表1 所示。引物均由北京華大基因生物技術有限公司合成。

表1 引物序列

利用Trizol 法提取胎鼠骨骼肌總RNA，采用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA，并在核酸蛋白測定儀上檢測cDNA 濃度，并稀釋至100 ng/μL。以cDNA 為模板進行熒光定量PCR，其中，反應體系為10 μL：SYBR Premix Ex Taq TMII（2×）5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補足到10 μL。反應條件為95 ℃2 min；95 ℃30 s，58 ℃34 s，40 個循環。

采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，其中GAPDH 為內參基因。利用SPSS 軟件中的獨立樣本t 檢驗法進行分析，用GraphPad Prism 軟件繪圖。

1.2.5 調控元件的生物信息學預測分析 用線上軟件Genomatix 中的MatInspector Program 對小鼠Myostatin、Pax3、Pax7 基因的5′調控區元件進行預測分析。

2 結果與分析

2.1 孕鼠胎盤羊水中GC 含量變化

采用ELISA 試劑盒檢測孕鼠胎盤羊水中GC含量變化結果如圖1 所示，地塞米松處理組的GC含量極顯著高于對照組（P＜0.01），表明前期處理時注射的地塞米松進入了孕鼠胎盤，可進行后續試驗。

2.2 胎鼠肌纖維顯微結構的變化

胎鼠骨骼肌HE 染色結果如圖2 所示，對照組的骨骼肌纖維緊密整齊，地塞米松處理組的骨骼肌纖維稀疏凌亂。表明對孕鼠注射的地塞米松可被胎鼠吸收，并對胎鼠骨骼肌的發育產生不良影響。

2.3 胎鼠骨骼肌Myostatin、Pax3 和Pax7 的表達變化

熒光定量檢測胎鼠骨骼肌Myostatin、Pax3 和Pax7 的表達結果如圖3 所示，地塞米松處理組Myostatin 的表達量升高，差異極顯著（P＜0.01）；Pax3 的表達量降低，差異顯著（P＜0.05）；Pax7 的表達量下降，差異極顯著（P＜0.01）。

2.4 小鼠Myostatin、Pax3 和Pax7 基因5′調控區元件預測結果

利用生物信息學軟件預測可知，各基因5′調控區存在許多肌肉發育相關的調控元件；經分析發現，Myostatin 基因5′調控區存在GRE、PAX7 等元件；Pax3 基因5′調控區存在GRE、nGRE（negative GRE）、PAX7 等元件；Pax7 基因5′調控區存在GRE、nGRE、PAX3 等元件（圖4）。預示著糖皮質激素可能通過糖皮質激素受體（GR）與糖皮質激素受體元件（GRE）結合而直接調控3 種靶基因的轉錄，也可能存在間接的相互調控關系。

3 結論與討論

糖皮質激素作為應激反應的重要參與者以及多種疾病的有效藥物，其對機體的利害雙重效應表現的極其復雜且不易平衡[16]，特別是對動物和人類胚胎期發育的負面影響，一旦發生便難以補救[17]。有研究表明，母體長期在不良環境下應激或糖皮質激素使用不當的情況下，會對胎兒發育帶來一定的副作用[18]，這種影響涉及到多個組織器官，其中包括骨骼肌組織。本研究中，ELISA 檢測結果顯示，地塞米松處理組母鼠羊水中的GC 含量顯著升高，表明地塞米松可通過胎盤屏障作用于胎鼠。通過顯微結構觀察發現，地塞米松處理組胎鼠的骨骼肌肌纖維明顯的發育不良，表明母體應激導致胎鼠肌肉發育障礙的模型構建成功。有研究發現，一定濃度的地塞米松可以影響成年鼠Myomaker 和MyoD 的表達[19]，胎兒在子宮內過早暴露于糖皮質激素，會損害肌肉生長。GOKULAKRISHNAN 等[20]給懷孕第13～21 天的大鼠注射地塞米松的研究發現，胎鼠Pax7、MyoD和MyoG 的表達發生了變化，進而抑制了肌祖細胞增殖，影響了骨骼的形成和發育。

動物胚胎期骨骼肌的發育是一個多種因子精細調控的復雜過程，其中，Pax3 是胚胎發育初期促進成肌發生的重要因子[21-22]，而Myostatin 則是成肌細胞增殖和分化的負調控因子[23]。本試驗中，熒光定量結果顯示，母體注射地塞米松胎鼠Myostatin的表達極顯著上調，而Pax3 表達顯著下調，說明糖皮質激素對胎兒骨骼肌發育的抑制作用可能與其調控了Pax3 和Myostatin 基因的表達有關。從出生時的肌肉表型看，Pax7 對胚胎期肌肉的形成和發育似乎并不是必需的，因為Pax7 基因敲除純合體胎鼠肌肉的發育在出生前并沒有受到影響[24]。所以，本試驗中，Pax7 基因表達的顯著下調應該不是導致胎鼠肌纖維發育受阻的主要原因。但事實上，由于Pax7 會影響胚胎期肌衛星細胞的形成和發育[25]，其在胚胎期的正常表達對動物出生后肌肉的發育和再生至關重要?？梢?，糖皮質激素在胚胎期對Pax7基因表達的影響可能會延伸到出生后肌肉的發育和再生能力。

糖皮質激素對基因的轉錄激活主要是通過糖皮質激素受體（GR）與糖皮質激素受體元件（GRE）結合來介導的[26]。利用生物信息學軟件對Myostatin、Pax3 和Pax7 的5′調控區分析發現，都存在GRE 元件，Pax3 和Pax7 的5′調控區還存在nGRE 元件。因此，糖皮質激素對胎鼠骨骼肌中這3 個基因的轉錄調控很可能是一種直接效應。當然，這種調控作用也可能是間接的，或者同時存在直接和間接2 種情況，因為通過生物信息學軟件分析發現，2 種轉錄因子Pax3 和Pax7 基因5′調控區各自存在對方的相應元件PAX7 和PAX3，而Myostatin 基因5′調控區也預測到PAX7 元件。這種復雜的相互調控機制還需要通過后續的體內和體外試驗進一步證實。

地塞米松處理孕鼠后可以通過胎盤屏障并調控骨骼肌發育相關基因Pax3、Pax7 和Myostatin 的轉錄表達，進而對胎鼠骨骼肌的發育造成不良影響，而糖皮質激素對相關基因的轉錄調控作用可能是直接或（和）間接的。本研究結果為后續深入研究家畜母體應激對胎兒骨骼肌發育影響的分子調控機制奠定了基礎，也為防治母體應激導致的胎兒骨骼肌發育受阻提供了理論依據。