外源H2O2 對NaCl 脅迫下苜蓿幼苗生理特性的影響

付 咪，何林衛，李鮮花，李 強

（1.榆林學院陜西省陜北礦區生態修復重點實驗室，陜西榆林 719000；2.榆林學院生命科學學院，陜西榆林 719000）

自然界中很多環境因子如鹽、重金屬、干旱等都會影響植物的正常生長發育，其中，鹽和重金屬是影響最普遍的2 種脅迫因子[1]。鹽脅迫對植物生長發育不同階段的影響有明顯差異，其中在植物種子萌發期受脅迫影響較為顯著[2]。植被生長發育時，如果有鹽脅迫存在，會使滲透脅迫增加而導致水分脅迫，從而造成土壤中其他植物毒素或離子增加[3]。除此以外，鹽脅迫還會降低碳的利用效率，對代謝途徑中的關鍵因子酶的活性造成抑制作用[4-5]。因此，對于鹽脅迫下如何提高植物的萌發及生長，揭示其影響機制成為目前植物生理方向研究的熱點[6]。有研究表明，鹽脅迫會抑制苜蓿正常的光合作用及生長發育[7]。我國鹽漬土面積范圍較廣，鹽脅迫會一定程度威脅到植物細胞的正常代謝過程[8]，對植物發芽率、發芽勢和一些生理生化指標有明顯的抑制作用。鹽脅迫對種子萌發和幼苗生長的影響研究表明，對植物危害較大的以Na 鹽和Ca 鹽為主，其中最常見的為Na 鹽[9]。大量研究表明，植物生長調節劑及礦質元素在提高植物抗逆性方面具有較大的應用潛力[10]。近年來，外源H2O2在提高植物發芽率、發芽勢、葉綠素含量等方面的研究也日益增多，利用外源物質誘導植物產生抗逆性是提高植物抵御不良環境的有效方法。過氧化氫（H2O2）是生物體內的一種活性氧分子，也是生物細胞應答逆境脅迫的重要信號分子，廣泛參與植物的抗性反應[11-12]。焦德志等[13]研究認為，植物在鹽脅迫下的主要生理響應是合成滲透調節物質，提高酶活性及植物抗鹽性。過氧化氫是植物代謝過程中重要的信號分子，對調節植物抗逆性具有重要作用[14]。有學者認為，外源H2O2可以改善植物生理特性，對提高植物抗鹽性具有一定的作用[15]。劉建新等[16-17]研究認為，外源H2O2顯著提高了燕麥保護酶活性，降低了電導率和MDA 含量，且外源H2O2可通過提高植物滲透物質含量以緩解鹽堿脅迫對植物生長的危害。霍平慧等[18]研究表明，100 mmol/L NaCl 對苜蓿種子萌發和幼苗生長均有抑制作用。

本試驗以不同品種的苜蓿種子為研究對象，探究外源H2O2對鹽脅迫下苜蓿幼苗生長及生理特性的影響，旨在為榆林地區苜蓿優質高效育種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為飽滿、大小均一且品質優良的甘農三號（GN3）、勞勃（LB）、敖漢（AH）3 種苜蓿種子。

1.2 試驗方法

試驗于2020 年4—9 月在榆林學院恒溫光照培養箱和生理生化實驗室進行。試驗共設7 個處理，分別為：CK1.不加NaCl 和H2O2營養液，為對照；CK2.100 mmol/L NaCl 溶液處理；T1.100 mmol/L NaCl 和0.05% H2O2；T2.100 mmol/L NaCl 和0.1%H2O2；T3.100 mmol/LNaCl 和0.5%H2O2；T4.100 mmol/L NaCl 和1% H2O2；T5.100 mmol/L NaCl 和2% H2O2。按照試驗設計，將苜蓿種子置于培養皿內，放入恒溫光照培養箱中培養，待種子萌發長出2 片子葉后，移植到裝有等量干凈沙土的花盆中，每盆移栽10 株，繼續放置于恒溫光照培養箱中培養。前期對所有盆栽進行Hoagland 營養液定期定量噴施[19]，待幼苗長出3 片子葉時，每天用H2O2處理液進行葉面噴施（等量20 mL），連續處理10 d 后停止，每個處理3 個重復。在苜蓿幼苗生長7 d 后在每個處理的3 個重復中隨機各取5 株采集葉片帶回實驗室進行各項生理指標的測定。

1.3 測定項目及方法

采用丙酮法[20]進行葉綠素含量測定；采用硫代巴比妥酸法[21]進行丙二醛（MDA）含量測定；采用紫外吸收法[22]進行過氧化氫酶（CAT）活性測定。

1.4 數據分析

所有數據均為3 次重復試驗結果的平均值，采用Microsoft Excel 2010 制圖，采用SPSS 23.0 軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 過氧化氫對苜蓿葉片葉綠素含量的影響

由圖1 可知，與CK1 相比，3 種苜蓿種子在CK2處理下葉綠素含量均降低，LB 降低0.27 mg/g，GN3降低0.54 mg/g，AH 降低0.19 mg/g，說明100 mmol/L NaCl 脅迫下，能顯著降低苜蓿幼苗葉綠素含量。3 個品種苜蓿在T1、T2、T3 處理下葉綠素含量分別高于CK2，且LB 的葉綠素含量在T2 處理最高，為0.92 mg/g，較CK2 增加0.46 mg/g，GN3 和AH 均在T3 處理下葉綠素含量最高，分別為1.03、0.66 mg/g，較CK2 分別顯著增加0.55、0.21 mg/g，說明一定濃度范圍的外源H2O2可提高苜蓿葉片葉綠素含量。對于3 個苜蓿品種來說，T2 和T3 處理對提高苜蓿葉綠素含量顯著優于T1 處理。在外源H2O2濃度為0.1%時會顯著提高100 mmol/L NaCl 脅迫下LB 葉綠素含量且葉綠素含量達到最大，外源H2O2超過該濃度葉綠素含量下降，與其他濃度外源H2O2處理相比，T5 處理葉綠素含量最低，為0.53 mg/g，但較CK2 增加0.12 mg/g。在外源H2O2濃度為0.5%時會顯著提高100 mmol/L NaCl 脅迫下GN3 和AH 的葉綠素含量，對葉綠素含量提高程度達到最高值，超過該值葉綠素含量呈現下降趨勢，說明外源H2O2超過一定濃度后會降低苜蓿葉綠素含量。

綜上所述，各處理下3 個苜蓿品種葉片中葉綠素含量的變化趨勢，與未經鹽脅迫（CK1）下相比，鹽脅迫（CK2）下，AH、GN3、LB 葉片中葉綠素含量均明顯下降，與CK1 相比，分別減少了0.27、0.54、0.19 mg/g，說明鹽脅迫會顯著降低苜蓿葉片葉綠素含量。隨著H2O2濃度的升高，3 個品種苜蓿葉片的葉綠素含量均呈現出先增后減的趨勢，但始終高于CK2 下的葉綠素含量，說明外源H2O2對提高鹽脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量效果顯著。

2.2 過氧化氫對鹽脅迫下苜蓿葉片中CAT 活性的影響

由圖2 可知，與CK1 相比，CK2 處理下3 個品種苜蓿葉片中CAT 活性均降低，LB 降低39.0%，GN3 降低22.5%，AH 降低37.6%，說明100 mmol/L NaCl 脅迫下，能顯著降低苜蓿幼苗葉片CAT 活性。

3 個品種苜蓿在T1、T2、T3 處理下CAT 活性分別高于CK2，且LB 和AH 葉片中CAT 活性均在T3處理最高，分別為1.19、1.48 U/（g·min），較CK2 分別顯著增加68.7%和78.3%，GN3 的T2 處理下CAT 活性最高，為1.40 U/（g·min），較CK2 顯著增加27.3%，說明不同濃度外源H2O2對苜蓿CAT 活性影響顯著，一定濃度范圍的外源H2O2可提高苜蓿葉片CAT 活性。

對于3 個苜蓿品種來說，T2 和T3 處理對提高苜蓿CAT 活性顯著優于T1 處理，且達到峰值，當外源H2O2濃度超過0.5%時，LB 和AH 葉片中CAT活性均呈現下降趨勢，當外源H2O2濃度超過0.1%時，GN3 葉片中CAT 活性呈現下降趨勢且下降幅度最大，說明不同濃度外源H2O2對苜蓿CAT 活性影響顯著性不同，H2O2超過一定濃度，在一定程度上會降低苜蓿CAT活性。T5 處理下LB、GN3、AH 的CAT活性均最低，分別為1.01、1.17、1.13 U/（g·min），較CK2分別增加50.7%、6.4%和36.1%。說明外源H2O2在鹽脅迫下會顯著提高苜蓿葉片中CAT 活性。

綜上所述，與未經鹽脅迫（CK1）相比，鹽脅迫（CK2）下，AH、GN3、LB 這3 種苜蓿葉片中CAT 活性均明顯下降，顯著低于CK1，較CK1 分別下降39.1%、22.5%、37.6%；外源H2O2可顯著提高鹽脅迫下苜蓿葉片中CAT 活性，但隨著H2O2濃度的升高，3 個品種苜蓿葉片的CAT 活性均呈現出先增后減的趨勢，但始終高于CK2 下的CAT 活性，說明過高濃度的H2O2反而不利于苜蓿葉片CAT 活性的提升，但外源H2O2在一定程度上可緩解鹽脅迫對苜蓿葉片CAT 活性的影響。

2.3 過氧化氫對鹽脅迫下苜蓿葉片中MDA 含量的影響

由圖3 可知，與未經鹽脅迫的CK1 相比，CK2處理下3 個苜蓿品種的葉片MDA 含量均顯著提高，說明在100 mmol/L NaCl 脅迫下，能顯著提高苜蓿幼苗葉片MDA 含量。

AH、GN3、LB 苜蓿葉片MDA 含量均在T1、T2處理下顯著下降，且T2 處理下降幅度最大，較CK2分別下降0.17、0.15、0.17 mmol/g，說明一定濃度外源H2O2可降低鹽脅迫下苜蓿葉片MDA 含量，從而較好地緩解鹽脅迫對苜蓿生長的危害。當外源H2O2濃度超過0.1%時，3 個品種苜蓿MDA 含量均呈現上升趨勢，說明過高濃度的H2O2處理反而加重了苜蓿幼苗的鹽脅迫危害。與其他濃度的外源H2O2處理相比，T5 處理下的LB、GN3、AH 葉片MDA 含量均達到最高，分別為0.62、0.50、0.53 mmol/g，但均低于CK2 處理下苜蓿葉片的MDA 含量，分別較CK2降低了0.07、0.15、0.08 mmol/g，說明100 mmol/LNaCl脅迫下，外源H2O2可有效降低膜過氧化程度，緩解鹽脅迫對苜蓿幼苗生長的危害。

3 結論與討論

鹽脅迫對植物細胞內葉綠素合成有抑制作用，植物光合作用主要依賴于葉綠素，其含量多少與植物光合作用的強弱直接相關。本研究表明，當H2O2濃度在0.1%～0.5%時，隨著H2O2濃度升高，可明顯提高苜蓿葉片中葉綠素含量，維護光合過程的穩定，增強植物的光合作用，這與趙萍萍[23]對小麥（Triticum aestivum）的研究結果相似。H2O2是細胞代謝過程中產生的一種廢物，在CAT 作用下H2O2可分解成氧和水。而鹽脅迫使得植物葉片內CAT 活性降低，因此，會造成H2O2的積累，從而對植物機體造成傷害。本研究結果表明，當H2O2濃度在0.1%～0.5%時，鹽脅迫下苜蓿葉片內CAT 活性隨著H2O2濃度升高而增強，從而有效緩解苜蓿幼苗的鹽脅迫，這與李源[24]對板藍根（Isatis indigotica Fort）的研究結果大致相同。在100 mmol/L NaCL 脅迫下，植物細胞內自由基產生和清理的穩定受到威脅，自由基過量會使細胞膜過氧化，MDA 含量增加，所以，葉片MDA 含量是衡量植物細胞膜脂過氧化的重要指標[25]，其含量的高低可以表征細胞受脅迫嚴重程度。外源H2O2濃度為0.1%時，可有效降低苜蓿葉片中MDA 含量，從而較好地緩解苜蓿幼苗的鹽脅迫危害，這與徐芬芬等[26]對水稻的研究結果相似。

綜上所述，100 mmol/L NaCl 脅迫下苜蓿幼苗葉片葉綠素含量和CAT 活性均下降，葉片MDA 含量上升，幼苗生長明顯受到抑制。添加一定濃度外源H2O2可顯著提高100 mmol/L NaCl 脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量、CAT 活性，有效降低膜脂過氧化，從而一定程度上緩解了100 mmol/L NaCl 對苜蓿幼苗生長的傷害，維持苜蓿幼苗的生長，提高苜蓿幼苗對鹽脅迫的抗性，但高濃度的H2O2同樣會不利于鹽脅迫下幼苗的生長，且不同品種苜蓿對不同濃度外源H2O2響應效果不同，以H2O2濃度不大于0.5%的效果最好。