豬肺炎支原體滅活疫苗的實驗室效力研究

李秋菊，王丹輝，沈青春，高玉龍

（1.松原職業技術學院，吉林 松原 138000；2.前郭縣動物疫病預防控制中心，吉林 松原 138000；3.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；4.吉林和元生物工程股份有限公司，吉林 松原 138000）

豬支原體肺炎 （Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由豬肺炎支原體 （Mycoplasma hyopne umoniae，Mhp）引起的一種慢性、接觸性呼吸道傳染病，臨床上有獨特的咳嗽和喘氣癥狀，又稱豬喘氣病或豬氣喘病[1]，該病分布十分廣泛，世界各地均有發生，也被認為是危害各國養豬業的重要疫病之一[2]。該病發病率高，發病慢且長，以冬春寒冷季節多發。發病豬表現為流涕，咳嗽，氣喘。死亡率雖不高但豬肺炎支原體也能夠導致由特定病毒性病原包括豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環2型病毒感染所引發的疾病[3]。

近年來，美國每年該病的疫苗產量一直占據榜首，主要為滅活疫苗，而我國多年來主要以研究活疫苗為主，近年也開始了滅活疫苗的研制工作。豬支原體肺炎滅活疫苗是最新研發用于預防豬支原體肺炎的滅活疫苗。該疫苗采用了田間分離的野毒菌株，免疫原性好。通過使用不同劑量的疫苗免疫健康仔豬，評價其攻毒保護力，確定其最小免疫劑量。本試驗結果對該疫苗的臨床使用有著重要的參考意義，同時也為進一步探明免疫保護率與替代動物抗體水平的相關研究提供技術數據。

1 試驗材料

1.1 試驗疫苗

豬支原體肺炎滅活疫苗 （S株）， 批號為202103，滅活菌滴度為 2.18×108CCU50/mL，規格為 20 mL/瓶。

1.2 攻毒菌種

豬肺炎支原體濟南株組織毒，批號為202101，1 mL/支。

1.3 試驗豬

7～14日齡健康仔豬，共45頭，仔豬均一性好，淘汰同窩中弱小仔豬，未免疫豬肺炎支原體疫苗；豬肺炎支原體抗體呈陰性，豬瘟、藍耳病和偽狂犬抗體均呈陰性。

1.4 試劑

豬肺炎支原體抗體ELISA檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司，2～8℃保存。豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸道綜合征病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒、豬偽狂犬病毒PCR檢測試劑盒，均購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，-15℃保存。

1.5 其他

無抗飼料購自北京科奧協力飼料有限公司。

2 試驗方法

2.1 試驗豬的篩選

篩選豬肺炎支原體抗體檢測應為陰性，豬瘟、豬藍耳病和偽狂犬抗原應為陰性，7～14日健康仔豬共25頭，前期與母豬一同飼養。

2.2 免疫前的準備及分組免疫

對每頭仔豬打耳標、稱重，分別使用2 mL(1～5號豬)、1 mL（6～10 號豬）、0.5 mL（11～15 號豬）和 0.25 mL（16～20號豬）劑量，每組5頭仔豬，兩次免疫分別在兩側頸部肌肉注射，同時設5頭不免疫對照組（21～25號豬），另外2 mL劑量組多免疫兩頭，為后續組織切片所用。

2.3 攻毒試驗

首免后28日，連同對照組5頭仔豬各氣管內接種1:100倍稀釋的豬肺炎支原體濟南株組織毒10 mL（約含肺組織0.01 g）。連續觀察28日后剖檢，觀察記錄肺臟病變情況。

2.4 觀測項目

2.4.1 體溫測定。分別于免疫前和免疫后對所有仔豬進行體溫測量，每天1次，持續7 d。

2.4.2 每日觀察注射部位情況，注射2 mL的試驗仔豬分別于二免后第7 d和第14 d各宰殺一頭，取注射部位的肌肉組織經10%福爾馬林固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色等，顯微鏡下觀察，并進行組織病理學評價。

2.4.3 稱重。于免疫、攻毒當日和試驗結束日對所有仔豬進行稱重。

2.4.4 肺臟病變評價及計算。按照規程附注5的評分標準對豬肺臟進行逐個評價，左、右心葉出現100%病變各記1分，左、右尖葉出現100%病變各記1分，左、右膈葉出現100%病變各記0.5分，中間葉出現l00%病變記0.5分，病變總分為5.5分。根據肺臟出現病變的輕重程度加減分值。同一個肺葉的正反兩面病變面積不一致時，取平均面積。如圖1中感染豬支原體肺炎的豬肺臟評分，左心葉病變70%，計0.7分；右心葉病變50%，計0.5分：左尖葉病變80%，計0.8分；右尖葉病變60%，計0.6分；左膈葉病變20%，計0.1分，右膈葉病變20%，計0.1分；中間葉病變40%，計0.2分，則病變總分=左心葉+右心葉+左尖葉+右尖葉+左膈葉+右膈葉+中間葉=0.7+0.5+0.8+0.6+0.1+0.1+0.2=3.0。

圖1 豬支原體肺炎的肺臟病變圖

保護率計算公式如下：

3 試驗結果

3.1 體溫變化情況記錄結果

免疫前1天和當天（免疫前），體溫測定結果如圖2所示。

圖2 不同劑量豬支原體肺炎滅活疫苗（S株）首免后仔豬體溫測定結果

以上結果顯示，健康仔豬免疫后體溫正常，疫苗免疫劑量與體溫變化關系不明顯。

二免前1天和當天，對各個滴度免疫組的試驗豬進行體溫測定，測定結果如圖3所示。

圖3 不同劑量豬支原體肺炎滅活疫苗(S株)二免后體溫測定結果

以上結果顯示，健康仔豬在免疫后體溫正常，疫苗免疫劑量與體溫變化關系不明顯。

3.2 注射部位的不良反應記錄結果

使用4種不同劑量的豬支原體肺炎滅活疫苗的注射部位是否有不良反應或變化，結果見表1。對注射2 mL劑量組仔豬注射部位的肌肉組織進行切片觀察，結果見圖4。

圖4 支原體肺炎滅活疫苗2 mL劑量免疫組仔豬注射部位病理組織切片結果

表1 不同劑量豬支原體肺炎滅活疫苗免疫仔豬后7日內注射部位反應情況觀察表

以上結果表明，2 mL試驗組有1頭仔豬，首免和二次免疫后1天注射部位出現稍稍發紅，第2天癥狀完全消失，恢復正常，其他試驗豬均表現正常。由此可見，4種免疫劑量的試驗豬2次免疫后注射部位均表現正常，沒有出現嚴重的不良反應，證明該疫苗對仔豬安全。

根據以上注射部位的肌肉組織病理切片圖顯示，仔豬在接種疫苗后，注射部位的肌肉組織均保持較好的細胞組織形態，沒有出現嚴重的炎性反應。

3.3 攻毒前后體重變化情況

在試驗期間的不同時間節點，對仔豬進行了稱重，以測定不同免疫劑量對仔豬經濟指標的影響，如表2所示。

表2 不同劑量豬支原體肺炎滅活疫苗（S株）免疫攻毒試驗中仔豬體重結果

以上結果表明，免疫試驗期間各組仔豬的體重增加差別不明顯，但免疫攻毒后差異較為顯著，免疫組增重明顯高于對照組，對照組個別豬還出現了體重稍有下降的情況。

3.4 免疫效力結果

根據剖檢后豬肺臟發生Mhp感染的病變情況，使用5.5分法進行評分和計算，結果詳見表3。

表3 免疫攻毒試驗中仔豬的肺臟病變計分情況及各組的保護效力情況

以上結果顯示，免疫組的仔豬肺部病變情況較對照組有明顯改善，而且隨著免疫劑量的增加，免疫攻毒保護效力也明顯增加，按照60%的保護率為合格標準，豬支原體肺炎滅活疫苗（S株）對7～14日齡仔豬的最小免疫劑量定為0.5 mL/頭，推薦使用劑量為1.0 mL/頭。

4 結論

本研究通過對豬肺炎支原體滅活疫苗 (S株)以2.0 mL、1.0 mL、0.5 mL、和 0.25 mL 四種劑量兩次免疫健康仔豬，整個試驗期間四個免疫劑量組的仔豬體溫均未出現明顯的變化，注射部位也沒有出現嚴重的不良反應，表明該疫苗對仔豬安全。攻毒保護率結果分別為77.9%、70.5%、65.3%、49.5%，按照60%以上即達到標準，該疫苗對7～14日齡仔豬的最小免疫計量可定為0.5 mL/頭，以最小免疫劑量的雙倍劑量作為推薦使用劑量，即1.0 mL/頭。該試驗為后續豬肺炎支原體滅活疫苗的研究奠定了基礎。