二代測序在膿毒癥患者病原學檢測中的應用價值

許小澤 黃澤偉 劉振密 肖衛民 蘇 闐 黃瑞坤 趙崇濤 劉雪燕▲

1.暨南大學第二臨床醫學院（深圳市人民醫院）重癥醫學科，廣東深圳 518020；2.深圳市泰康吉音生物科技研發服務有限公司技術部，廣東深圳 518000

膿毒癥是指因感染引起的宿主免疫反應失調導致的危及生命的器官功能障礙[1]，其起病急、進展快、病原體復雜，可導致全身多器官功能障礙乃至迅速衰竭，短時間內能否明確致病病原微生物對指導治療和改善預后具有重大意義。目前，臨床工作中常用病原體檢測方法主要為傳統微生物培養，存在培養時間長、檢出率低、覆蓋面小等缺陷[2]，無法滿足膿毒癥患者進行靶向抗菌治療的亟需性。二代測序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）技術為新型病原檢測手段，具有快速、陽性率高、覆蓋面廣等優勢，尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷[3]，但臨床中尚未廣泛使用。本研究通過比較分析mNGS 與傳統血培養兩種病原檢測方法的病原體檢出率，進一步分析抽樣前有無使用抗生素對兩者的檢出影響，旨在為明確mNGS 在膿毒癥患者中的應用價值提供一定的科學證據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月—2019年9月深圳市人民醫院重癥醫學科收治的118 例膿毒癥患者進行回顧性分析，收集研究對象的一般信息（包括住院號、姓名、性別等等）、診斷、入科時急性生理學與慢性健康狀況系統評估Ⅱ（systematic assessment of acute physiology and chronic health conditions，APACHE Ⅱ）評分、序貫器官衰竭（sequential organ failure，SOFA）評分、感染部位、白細胞計數（white blood cell count，WBC）、中性粒細胞比例（neutrophil ratio，Neu%）、C-反應蛋白（Creactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、乳酸（lactic acid，Lac）、入科前有無使用抗生素、治療過程中是否使用血液凈化及呼吸機、28 d 預后情況、院內血漿微生物培養結果、Mngs 報告等。納入標準：①年齡≥18 歲；②膿毒癥診斷符合Sepsis-3[1]中的診斷標準；③入科24 h 內有留取血漿樣本進行微生物培養及二代測序檢驗；④患者或其家屬已簽署知情同意書。排除標準：①入科后24 h 內自動出院或死亡患者；②血漿樣品受到污染；③病例數據不全。本研究符合醫學倫理學標準，研究方案經深圳市人民醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 血培養 采用梅里埃BacT/ALERT 3D120 全自動血培養儀進行血液微生物培養，嚴格按照該儀器說明書步驟進行操作，同時需注意以下幾點。①采血時機：入科24 h 內采血，盡可能地在抗菌藥物使用前采血，寒戰和發熱初起時采血；②采集方法：確保醫護人員手衛生，確保血培養瓶合格并在有效期內且無破損，對患者皮膚進行嚴格仔細消毒處理，規范進針采血，血液注入培養瓶后輕搖以防血液凝固；③標本運送：確保取樣后2 h 內標本送檢。1.2.2 mNGS 檢測流程 留取血漿樣品，無菌條件下送往深圳泰康吉音生物科技研發服務有限公司進行mNGS 病原體檢測，主要方法及步驟：游離DNA 的提取（按照QIAGEN QIAamp UltraSens Virus Kit 的標準流程操作）→末端補平DNA（使用的建庫試劑盒為Ion Plus Fragment Library Kit，補平DNA 取值50～100 ng）→使用試劑純化補平的DNA，并做片段選擇→連接接頭，缺口平移→使用試劑純化連接后的DNA→文庫擴增→使用試劑純化DNA→文庫檢測→上傳分析→生成報告。主要材料來自賽默飛LIFE，具體名稱及貨號見表1。

表1 mNGS 主要材料

1.3 觀察指標及評價標準

描述研究對象的臨床特征及預后信息、mNGS 與微生物血培養的病原體檢出情況，比較分析兩者的差異性。以微生物血培養作為菌血癥的金標準，當檢驗到細菌或真菌時認為樣本陽性，計算mNGS 的靈敏度、特異性、約登指數，進一步比較分析抗生素的使用與否對兩者方法的檢測影響，綜合分析討論mNGS在臨床診治中的應用價值。靈敏度=真陽性例數/（真陽性+假陰性）例數×100%，特異性=真陰性例數/（真陰性+假陽性）例數×100%，約登指數=靈敏度+特異性-1。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計軟件對數據進行分析，正態分布的連續變量以均值±標準差（±s）表示，采用Mc-Nemar χ2檢驗進行病原體陽性檢測率的比對分析，采用Chi-square χ2檢驗分析抗生素對病原體的檢測影響，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征及預后

納入的118 例患者均符合Sepsis-3 的膿毒癥診斷標準，其中膿毒癥61 例（51.69%），膿毒性休克57例（48.30%）；平均年齡為（59.14±18.78）歲，入住深圳市人民醫院重癥醫學科時APACHEⅡ評分為（18.33±7.66）分，SOFA 評分為（8.83±4.00）分。主要感染部位分布中，肺部感染50 例（42.37%），腹部感染37 例（31.36%），泌尿系感染14 例（11.86%），其他部分感染17 例（14.41%）。入科時即刻測得WBC 為（13.31±9.48）×109/L，Neu%為（85.39±14.29）%，CRP 為（165.36±117.94）mg/dL，PCT 為（61.31±76.25）ng/mL，Lac 為（4.78±5.06）mmol/L。入科前有87 例（73.73%）患者已使用過抗生素。治療期間，有46 例（38.98%）患者使用血液凈化治療，78 例（66.10%）患者需要呼吸機輔助通氣。28 d 死亡率為30.51%（36 例）。

2.2 病原體檢出情況

mNGS 病原體檢出率為35.59%，明顯高于微生物血培養的檢出率（16.10%），差異有統計學意義（P=0.000），具體見表2。進一步計算mNGS 的靈敏度、特異性、約登指數，分別為78.95%、72.73%、51.68%。在病原體檢出分布方面，本研究結果顯示，mNGS 不僅能檢出細菌、真菌，還能鑒別出病毒、衣原體等病原體，具有更廣的覆蓋面，具體見圖1（封四）。

表2 微生物培養和mNGS 的血漿樣品病原體檢出情況

圖1 病原體的檢出分布圖

2.3 抗生素對病原體的檢測影響

對于微生物血培養，若在入科前已使用抗生素，其檢出率較尚未使用抗生素明顯減低（9.19%vs.35.48%，χ2=9.827，P=0.002）；而是否使用抗生素對mNGS 在病原體方面的檢出率影響差異無統計學意義（37.9%vs.29.03%，χ2=0.790，P=0.374）。另外，入科前已經使用抗生素的87 例患者中，mNGS 的檢出率明顯高于微生物培養（37.9%vs.9.19%，P=0.000）；入科前尚未使用抗生素的31 例患者中，兩種方法的檢出率比較，差異無統計學意義（29.03%vs.35.48%，P=0.687）（表3）。

表3 有無抗生素對病原體的檢測影響

3 討論

膿毒癥和膿毒性休克是急危重癥醫學面臨的重要臨床問題，全球每年膿毒癥患病人數超過1900 萬，其中有600 萬患者死亡，病死率超過1/4，存活的患者中約有300 萬人存在認知功能障礙[4-6]。治療時間窗在膿毒癥患者的治療中至關重要，早期治療（包括抗生素管理和感染源控制）是決定性的第一步，可以極大地影響患者的治療及預后情況[7]。當前的指南建議盡早開始抗菌治療，最好在確認膿毒癥后1 h 內啟動靜脈抗菌藥物治療[8]。但是，大多數早期治療都是經驗性的，并且有46%的經驗性抗生素治療是不合適的，更有35%的死亡率與之相關[9]。據報道，大約50%的經驗性治療是不必要的，或者范圍太廣，增加了耐藥性和毒性的風險[10]。因此，早期識別膿毒癥患者感染病原體并進行靶向抗菌治療對改善患者的結局至關重要。大量研究也反復強調早期病原體識別是抗生素靶向有效治療的關鍵[11]。然而在許多臨床診治中，確定病原體仍具有挑戰性，許多常見的病原體很難或者根本無法在體外培養[12]，若是深部的感染通常需要對感染組織進行侵入性活檢才能做出診斷[13]。

長期以來，微生物培養是診斷病原體最常規的技術，也一直是指導膿毒癥抗生素使用的重要依據，但該技術存在不少缺陷，臨床實驗室一般只能進行細菌或真菌的培養。本研究納入的118 例患者中，血培養結果顯示也是局限于細菌和真菌的回報，并且培養周期較長（3～7 d），陽性率偏低，受抗生素的使用影響較大，存在較高的假陰性可能[14]。雖然可以通過反復多次送檢提高陽性率，但往往會延誤正確治療的最佳時機，特別是在面對膿毒性休克的迅速進展時。基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的病原學檢測技術具有極高的靈敏度及特異性，并可在一定程度上加快病原體的鑒定速度，但其只能對已知病原微生物進行檢測，在選擇檢測之前需要進行推定性診斷，無法完成高通量篩查，整體檢出率亦偏低[15]。免疫學方法（包括免疫熒光、ELISA、補體結合試驗等等）在病原體判斷方面具有操作簡單的便捷性以及極高的特異性，但由于病原體種類繁多（據報道，已知有高達1000 多種微生物可感染人類），目前研發的抗原抗體數量遠不及臨床需要。另外，WBC、Neu%、CRP、PCT、Lac 等生化指標雖可在膿毒癥的早期診斷方面具有一定的參考價值，但特異性不高，更是無法明確具體病原體，對于選擇抗生素的指導性不強[16]。因此，為解決早期明確膿毒癥患者感染病原體的問題，尋找一種時效快、敏感度高、特異性強、覆蓋面廣的診斷技術迫在眉睫。本研究所使用的mNGS 技術來自于泰康吉音生物科技研發服務有限公司，是基于二代高通量測序平臺產品的序列數據，無需特異性擴增[10]，可直接通過微生物專用數據庫進行比對分析，經過智能化算法獲得疑似致病微生物的種屬信息，并提供全面深入的報告參數輔助臨床診療決策。此技術針對血流感染、神經系統感染、呼吸道感染及消化道感染癥候群，可檢測60 000 余種微生物，包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體、衣原體、立克次氏體、螺旋體等，輔助臨床醫生制訂精準診療方案。

本研究納入的118 例研究對象的臨床資料顯示，患者平均年齡達到（59.14±18.78）歲，70 歲以上更是占33.9%（40/118），提示老年人是膿毒癥患者的主要群體，這也是與老年人本身基礎情況偏差有關。在主要感染部位分布方面，肺部（42.37%）感染為主，其次是腹部（31.36%）感染，與近年來國內外研究結果基本一致。入科時即刻測得的WBC 為（13.31±9.48）×109/L，Nec%為（85.39±14.29）%，CRP 為（165.36±117.94）mg/dL，PCT 為（61.31±76.25）ng/mL，Lac 為（4.78±5.06）mmol/L，均較正常值明顯升高，提示處于重癥感染狀態，需要盡早行靶向抗感染控制。在治療方面，有46 例（38.98%）患者使用血液凈化治療，78 例（66.10%）患者需要呼吸機輔助通氣。在28 d 預后方面，有36 例（30.51%）患者死亡，與近年來國際相關研究報道的膿毒癥死亡率基本一致[17]。

在病原體檢出方面，早期Long 等[18]在北京協和醫院納入78 例膿毒癥患者血樣行普通血培養和mNGS 研究，結果顯示mNGS 可顯著提高病原體的檢出率（30.77%vs.12.82%）。本研究結果顯示，mNGS病原體檢出率為35.59%，高于微生物血培養的檢出率（16.10%）（P=0.000）。同時，若以微生物血培養作為菌血癥的金標準，當檢驗到細菌或真菌時本研究認為樣本陽性。本研究中，mNGS 的靈敏度、特異性、約登指數分別為78.95%、72.73%、51.68%，提示mNGS 不僅可提高膿毒癥的病原體檢出率，更是具有較高的靈敏度和特異性。在檢測結果回報的時間方面，本研究沒有詳細記錄從樣本采集、樣本寄送到樣本核酸開始提取這段時間，而深圳泰康吉音生物科技研發服務有限公司進行mNGS 病原體檢測的總時間為（32±4）h，短于傳統微生物培養時間，往后可以在樣本采集及樣本寄送步驟方面加快效率，爭取更短的時間得到mNGS 的結果。既往關于膿毒癥流行病學的調查報道顯示[19]，膿毒癥最常見的病原菌為G-菌，約占58%；其次為G+菌、真菌等，這與本研究的結果基本一致。微生物培養中，G-菌、G+菌、真菌分別為63.16%、21.05%、15.79%；而mNGS 結果中，G-菌為56.87%，G+菌為27.45%，真菌為1.96%，病毒為9.80%，衣原體為3.92%，提示mNGS 在病原體檢測方面具有更廣的覆蓋面，可以檢測到血培養無法培養的如病毒、衣原體等更多種類的微生物，Decker 等[20]和Piantadosi 等[21]的研究報告也進一步證明了mNGS 可檢測到更多的特殊病原體。此外，關于檢出的具體病原學分布中，本研究顯示“肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌”占據比例最多，這與李翠翠等[22]、劉艷君等[23]在血流感染病原菌的調查研究中的結果相似。進一步觀察，本研究顯示mNGS 在“肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌”的陽性回報絕對量遠遠高于血培養，具體序列數較其他病原菌也呈現高表達，提示mNGS 在不同病原體的檢出性能方面具有一定的差異性，所以在擬定陽性病原體序列數界值方面要盡量做到個性化，這也是本課題組接下來的進一步研究。最值得關注的是，本研究發現抽樣前使用抗生素對mNGS 的檢出率影響較小（37.90%vs.29.03%，P=0.374），但能夠明顯降低微生物培養的檢出率（9.19%vs.35.48%，P=0.002）。另外，單獨分析87 例抽樣前已使用抗生素的患者，本研究發現有25 例患者通過mNGS 可以檢測出相關病原體，而微生物培養為陰性；在僅有的8 例微生物培養陽性患者中，均有對應的mNGS 陽性結果，這可能與mNGS 的測序原理相關。因為即使被抗生素殺滅后的部分病原體仍可釋放核酸，仍可被提取檢測出來，從而提高了mNGS 的靈敏度。

綜上所述，mNGS 在膿毒癥中具有一定的應用價值，可明顯提高病原體的檢出率，縮短檢測時間，在病原學的診斷方面具有較高的靈敏度、特異性，更是具有廣覆蓋的特性，受抗生素的影響較小。因此，筆者建議將mNGS 技術廣泛應用于膿毒癥的臨床診治中，力爭做到針對病原菌的早期靶向干預，改善預后。