生物可降解鎂對人膽管癌細胞和小鼠H22腫瘤抑制作用研究

李 天， 劉 沖， 何金瞳， 張丹陽， 隋凱達， 張洲博， 邵海波

原發性肝膽腫瘤包括肝細胞癌和膽管癌，肝細胞癌可能以腫瘤壓迫、瘤栓形成、彌漫性腫瘤浸潤等方式累及膽道［1］，引起膽道狹窄或阻塞，而膽管癌晚期也可引起膽管狹窄和梗阻［2］。膽道支架植入術已成為緩解晚期梗阻性黃疸、延長患者生存期的有效方法［3］。然而膽道支架植入術后再狹窄率超過50%［4］，主要由腫瘤侵入導致，相當多患者需要再次干預［5］。傳統膽道支架材料為鈦合金，在體內不能降解，對腫瘤生長無抑制作用。近年來具有可降解性質的金屬鎂以良好的力學性能和生物相容性、較高的生物活性和可降解性顯示出巨大的應用潛力，已成為生物醫用材料領域研究熱點［6］。鎂金屬作為植入醫療器械材料在骨折內固定［7］，骨組織多孔支架和心血管支架［8-9］，食管良性狹窄藥物鎂合金支架及胃腸外科手術［10-11］中均得到廣泛研究或應用。有研究證明，金屬鎂在降解過程中可抑制骨肉瘤、口腔表皮樣癌等腫瘤細胞生長［12-14］。為探討可降解金屬鎂應用于膽道支架材料解決腫瘤侵入支架所致膽道支架再狹窄的可行性，本研究利用人膽管癌細胞觀察鎂降解引起的細胞毒性、細胞凋亡，采用H22荷瘤小鼠模型觀察純鎂在腫瘤組織中的生物降解過程及其對腫瘤生長的抑制作用，并對其可能的作用機制進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 樣品制備和材料表征

實驗所用金屬材料由中國科學院金屬研究所制備并提供，鑄態純鎂純度為99.95%，擠壓成型，選擇鈦合金（Ti6AL4V）作為陰性對照，培養基作為空白對照。實驗前將樣品打磨至2.5 μm級，用丙酮和無水乙醇超聲清洗，紫外線正反兩面照射30 min消毒待用；金屬片用于提取浸提液，尺寸為10 mm×15 mm，按可降解材料表面積/浸提介質為1.25 cm2/mL比例，加入含10%胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）細胞培養液，置于37℃恒溫箱中浸提，分別于第1、3、5天檢測各組浸提液pH值。金屬絲直徑1.5 mm，長度10 mm，用于體內植入實驗。

1.2 細胞培養

實驗所用細胞系為人膽管癌細胞（RBE），由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。用90%不完全RPMI-1640培養基（美國HyClone公司）、10%FBS配置細胞培養液，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，每2天更換1次培養基。

1.3 鎂體外抑制腫瘤實驗

1.3.1 細胞毒性 采用細胞抑制率（%）作為細胞膜完整性指標，并作為細胞毒性一般指標。將RBE細胞（100 μL）分配在96孔板（2×103個細胞/孔）并置于37℃、5%CO2培養箱內培養過夜，待細胞貼壁后處理。棄掉培養液后，實驗組分別在每孔加入純鎂和鈦合金于第1、3、5天的浸提液200 μL，空白對照組加入相同體積培養液。培養24 h后，棄去各孔培養液，向每孔加入100 μL細胞培養基及10 mL細胞計數試劑盒（CCK）-8溶液（上海碧云天生物技術公司），放入細胞培養箱中繼續孵育3 h后用酶標儀OD490 nm處檢測各孔吸光值。計算各組細胞抑制率（%），即抑制率＝（1－實驗組/空白對照組）×100%。

1.3.2 細胞凋亡 采用膜聯蛋白（annexin）Ⅴ-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染試劑盒（上海碧云天生物技術公司）檢測RBE細胞凋亡率。取對數生長期細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入純鎂和鈦合金第1、3、5天浸提液，空白對照組加入相同體積培養液。培養24 h后，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化收集細胞，冷的磷酸緩沖液（PBS）洗滌離心細胞2次，加入100 μL 1×結合緩沖液（binding buffer）后置細胞懸液于流式管內，分別向各組中相應加入annexinⅤ-FITC和PI各5 μL，避光孵育15 min，最后每管加入400 μL 1×結合緩沖液，震蕩后用流式細胞儀進行檢測。計算凋亡率后進行統計分析。

1.4 體內抑制腫瘤實驗

所有動物實驗均遵循《中國醫科大學實驗動物規范》。

1.4.1 體內抑制腫瘤作用 動物實驗選用近交系Balb/c小鼠，皮下腫瘤最長徑約0.8 cm時入組。隨機分為純鎂組和鈦合金組，每組20只。所有手術器械經高壓蒸汽法滅菌，手術臺乙醇消毒，小鼠以1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg劑量腹腔注射麻醉；切開小鼠皮膚，暴露腫瘤組織，金屬絲橫穿腫瘤組織；縫合傷口，繼續飼養。在第3、6、9、12、15天分別測量每組小鼠腫瘤最長徑和最短徑（n=6），處死每組3只小鼠，觀察腫瘤生長情況。根據Steel公式計算腫瘤體積，即體積＝（短徑2×長徑）/2（mm3）。

1.4.2 體內金屬降解 在第3、6、9、12、15天處死小鼠，依次將小鼠俯臥于檢查臺上，進行鉬靶X線攝影（曝光條件：28 kV，18 mAs），監測體內金屬降解情況。

1.4.3 組織病理學分析 術后第15天，腫瘤組織以4%多聚甲醛固定2周，石蠟包埋，切片，制備腫瘤切片進行組織病理學分析。常規蘇木精-伊紅（HE）染色，免疫組織化學染色。經脫蠟、脫水、修復、滅活和阻斷后，組織切片分別與低氧誘導因子（HIF）-1α（1∶100）一抗和碳酸酐酶（CA）Ⅸ（1∶500）一抗（英國Abcam公司）在4℃孵育過夜。二抗孵育后，用二氨基聯苯胺（DAB）染色。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測材料周圍腫瘤細胞凋亡情況。最后在顯微鏡下觀察染色結果。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。兩組間同一時間點比較用兩樣本t檢驗，3組數據比較用方差分析和Bonferroni兩兩均數比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 純鎂浸提時間對pH值影響

分別測定各組第1、3、5天提取液pH值，結果表明，隨著純鎂浸提天數增加，浸提液pH值逐漸增加，其各個時間點pH值均顯著高于鈦合金浸提液；第5天純鎂浸提液pH值最高可達到11.0，而鈦合金浸提液pH值最高則維持在8.6，見圖1。

圖1 不同時間點各組對應pH值

2.2 純鎂浸提液對RBE細胞增殖影響

CCK-8試驗結果表明，第1、3、5天純鎂浸提液均抑制RBE細胞增殖（P＜0.05），且呈現明顯的時間依賴性。第1、3、5天純鎂浸提液對RBE細胞抑制率分別為24.7%、60.2%、70.7%，而鈦合金浸提液分別為-3.1%、1.3%、1.0%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同時間點不同材料浸提液對RBE細胞毒性的影響

2.3 純鎂浸提液對RBE細胞凋亡影響

流式細胞儀檢測結果顯示，純解鎂浸提液可誘導RBE細胞凋亡，隨著浸提時間延長和pH值增高，凋亡細胞百分比相應增加。第1、3、5天細胞凋亡率，純鎂浸提液分別為13.8%、33.8%、46.7%，鈦合金浸提液分別為6.1%、7.1%、5.6%，空白組為4.1%，純鎂組與空白對照組、鈦合金組差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 不同時間點不同材料浸提液對RBE細胞凋亡的影響

2.4 純鎂對小鼠H22腫瘤生長的影響

通過對小鼠腫瘤體積和重量的監測，結果如圖4所示。隨著時間增加，植入純鎂金屬絲小鼠腫瘤大小和重量均明顯小于鈦合金金屬絲處理的腫瘤。第9、12、15天，植入鈦合金小鼠腫瘤平均體積分別為11.4 cm3、18.0 cm3、21.7 cm3，而植入純鎂小鼠腫瘤平均體積分別為5.6 cm3、8.2 cm3、11.2 cm3，差異均有統計學意義（P＜0.05）。術后小鼠生存率達到90%以上，生存時間可達25 d；因腫瘤組織過大，對小鼠實施安樂死。

圖4 不同時間點不同材料組小鼠H22腫瘤重量和體積

2.5 純鎂在小鼠H22腫瘤中降解情況

從鉬靶影像（圖5）上可以看到，隨著時間的推移，傳統鈦合金材料在小鼠體內并未發生明顯變化。與鈦合金相比，純鎂金屬邊緣變得模糊，且在金屬周圍存在少量氣體。

圖5 不同時間點不同材料在小鼠H22腫瘤內降解情況

2.6 純鎂植入小鼠H22腫瘤后組織病理學分析

通過術后第15天腫瘤組織HE染色、TUNEL染色和免疫組織化學染色，進一步證明純鎂對腫瘤細胞的抑制作用。HE染色上可看到植入純鎂的材料周圍腫瘤細胞皺縮，細胞核消失。TUNEL染色凋亡細胞標記為棕色，純鎂組凋亡細胞比率為平均9.7%，而鈦合金組為5.3%，差異有統計學意義（P＜0.05）；免疫組化染色結果顯示，植入純鎂小鼠腫瘤組織CAⅨ蛋白表達顯著降低（P＜0.05），其上游蛋白HIF-1α也有下降，但未達到統計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 不同材料對小鼠H22細胞凋亡及相關蛋白的影響（×100）

3 討論

支架內再狹窄已成為目前影響惡性梗阻性黃疸膽道支架植入術后療效和預后的主要原因，盡管再狹窄原因中良、惡性因素混雜，但惡性腫瘤生長仍然是影響支架遠期通暢率和患者預后的主要因素［15］，尤其是肝細胞癌、膽管癌呈浸潤性生長趨勢時，往往可很快生長入支架內［16］。因此，如何預防膽道支架植入術后再狹窄成為臨床研究熱點。目前研究主要集中在支架材料、覆膜支架、光動力療法、支架植入術后聯合介入治療及放化療［15，17］。生物可降解金屬鎂在降解過程中被證實具有良好的抗腫瘤性能，但能否抑制肝膽腫瘤尚不清楚。本研究分別采用人膽管癌細胞和H22荷瘤小鼠模型，旨在體內外測試可降解金屬鎂對腫瘤生長的影響。本實驗結果表明，隨著純鎂浸提天數增加，其pH值逐漸增加（圖1）；純鎂浸提液對RBE細胞毒性與對照組相比顯著增加，隨著浸提時間增加，細胞毒性也越來越大（圖2）。有研究證明堿性環境能抑制腫瘤細胞生長，金屬鎂降解時溶液中主要產物是Mg（OH）2，但溶液中Cl-使Mg（OH）2轉換為MgCl2，溶液中OH-增多，導致溶液中pH迅速上升［18］。Witte等［19］研究顯示體內外金屬鎂均能顯著增加材料周圍的堿度，從而抑制在此環境中殘存的腫瘤細胞。Wang等［13］研究顯示Mg2+濃度在50 mmol/L時，骨肉瘤U2-OS細胞于第7天相對生長速率（RGR）為98.6%，并無明顯細胞毒性，且其在腐蝕介質環境中的主要降解產物為Mg（OH）2。Pompa等［20］研究表明，金屬鎂對正常小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）毒性處于理想范圍內。因此可推測純鎂浸提液能抑制RBE增殖，可能與其降解導致浸提液pH上升，改變了腫瘤生長的酸性環境有關。腫瘤細胞凋亡調控失調導致的細胞凋亡抵抗（resistance to apoptosis）是腫瘤發生的主要原因之一［21］。本研究進一步采用流式細胞術體外觀察純鎂對RBE細胞凋亡的影響，發現純鎂浸提液可導致RBE細胞凋亡，凋亡細胞數隨著浸提天數增加而增加（圖3），這與前述RBE細胞CCK-8結果相一致。

本實驗結果表明，純鎂與鈦合金同時植入小鼠H22皮下腫瘤后第3、6、9、12、15天，純鎂組腫瘤體積增長更慢（圖4），金屬邊緣變得模糊，周圍有一定的氣體產生（圖5），鉬靶攝影也觀察到體內氣體產生。Wang等［13］研究顯示可降解鎂材料降解時產生氣泡，不利于腫瘤細胞黏附生長。CAⅨ是一種缺氧導致高表達的腫瘤相關蛋白，是HIF-1α下游蛋白，正常組織中幾乎不表達，而腫瘤組織中呈高表達。CAⅨ參與調節腫瘤細胞增殖、轉移和侵襲，并可使腫瘤細胞維持周圍微環境弱酸性，適應微環境變化，促進腫瘤侵襲、轉移和對放療的抵抗［22］。本實驗結果顯示，純鎂組小鼠腫瘤組織中CAⅨ含量較鈦合金組明顯降低，其上游蛋白HIF-1α雖有變化，但差異無統計學意義（圖6），這也與浸提液中pH值變化相對應。不過還需要進一步實驗補充證明這一觀點。本研究還觀察到植入純鎂的腫瘤細胞凋亡率相比鈦合金更高（圖6），進一步證實可降解金屬鎂對腫瘤細胞有一定的抑制作用。

綜上，本研究表明可降解金屬鎂是一種具有選擇性、有潛力抗腫瘤的膽道支架材料。可降解金屬鎂在體內腐蝕雖較快，但通過合金化、表面處理和特種加工工藝等方法可有效提升鎂合金材料的耐腐蝕性能，滿足臨床上對其降解率的要求，且研究證明經過微弧氧化處理的純鎂降解速率變慢［23-24］。然而可降解金屬鎂與鈦合金相比對腫瘤細胞仍有一定毒性作用［25］。本研究僅探究純鎂與傳統鈦合金相比對腫瘤的抑制作用，未檢測其他鎂合金對腫瘤的抑制作用。Qiao等［26］研究顯示，可降解金屬鎂植入動物體內腫瘤后對其他臟器并無明顯毒性作用。但可降解金屬鎂抑制腫瘤的機制仍需更多實驗研究加以證明。鎂基金屬材料在抑制腫瘤作用方面，相對于現有鈦合金材料有獨特優勢，有望成為一種可行的膽道支架替代材料。