幽門螺桿菌感染介導(dǎo)IL-1β升高導(dǎo)致C57BL小鼠骨骼肌衰減①

李夢俊 張曉榮 王 婧 高艷萍 （山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，汾陽032200）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種在自然界中普遍存在的革蘭氏陰性微需氧細菌，在全世界50%以上人口的腸道內(nèi)定植，其感染胃竇上皮區(qū)并持續(xù)很長時間［1］。有研究表明，Hp 已經(jīng)發(fā)展出復(fù)雜的形態(tài)特點來擴大胃黏膜的炎癥程度，如螺旋形，鞭毛運動，趨化，和生產(chǎn)脲酶中和胃的酸性環(huán)境［2］。有來自細菌和宿主的多種因素參與了這些復(fù)雜的相互作用。另一方面，為了建立持久性感染，Hp通過模仿宿主抗原來逃避免疫系統(tǒng)，這種病原體有躲避免疫系統(tǒng)的能力，然后以宿主細胞的形式存在，從而導(dǎo)致免疫耐受［2-4］。此外，Hp 還具有多種基因，這些基因可能從寄主處獲取營養(yǎng)以在寄主體內(nèi)存活更長時間，Hp 的持續(xù)存在會引起慢性炎癥，并可能增加慢性疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，Hp的持續(xù)存在可能會造成骨骼肌衰減。

IL-1β 是區(qū)域性和全身性炎癥的主要刺激因子，是一種主要的促炎癥介質(zhì)，可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和具有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶產(chǎn)生，可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨中膠原Ⅱ和蛋白多糖下調(diào)［5］。此外，IL-1β 刺激的骨骼肌細胞可激活環(huán)氧合酶-2（cy?clooxygenase-2，COX-2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（in?ducible nitric oxide synthase，iNOS）表達，觸發(fā)前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和一氧化氮（nitric ox?ide，NO）釋放，引起慢性炎癥，誘發(fā)骨骼肌衰減［6］。

Hp感染率隨著年齡的增長而增加，可引起全身性炎癥反應(yīng)，ZEMBRO?-?ACNYA 等［7］發(fā)現(xiàn)，肌肉減少癥（以下簡稱“肌少癥”）者的血清炎癥因子水平升高，通過抑制炎癥患者肌肉質(zhì)量及力量均有明顯改善。2010 年老年肌少癥歐洲工作組（European Working Group on sarcopenia in older people，EWGSOP）［8］和 2011 年 國 際 肌 少 癥 會 議 工 作 組（International Sarcopenia Conference Working Group，ISCCWG）［9］進一步將肌少癥定義為“一種廣泛的、漸進性的骨骼肌量和肌力喪失，伴有身體活動障礙、生活質(zhì)量降低等不良后果風(fēng)險的綜合征”。有研究表明，在骨骼肌生成過程中，有3個起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族：配對盒蛋白（paired box，PAX）家族、同源異形框基因（sine oculis homeobox，SIX）家族和生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族，其中MRFs 在細胞成肌決定及終末分化階段起主要作用［10］。MRFs轉(zhuǎn)錄因子家族有4個成員：肌肉分化因子 1（myogenic differentiation 1，MYOD1）、生肌決定因子5（myogenesis determining factor 5，MYF5）、MYF6 和肌細胞生成素（myogenin，MYOG）。MYOD1是肌肉組織特異的轉(zhuǎn)錄因子，在肌細胞分化中起重要作用；MYOG 是成肌細胞終末分化階段的核心調(diào)控因子，作為分化調(diào)控因子參與成肌細胞的終末分化階段，當(dāng)MYOD1 或MYOG 表達下降時，肌細胞分化過程受阻，導(dǎo)致骨骼肌衰減，最終引起肌少癥［11］。因此，骨骼肌衰減的診斷成為防治肌少癥的突破點，以便實現(xiàn)肌少癥的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，提高老年人生存質(zhì)量，減少醫(yī)療資源的消耗，減輕社會負擔(dān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與菌株 體重28～32 g 的雄性8 月齡C57BL/6 小鼠購自山西醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)室，生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉）2015-0001。實驗小鼠在25℃、相對濕度60%、通風(fēng)良好的環(huán)境下，每天給予充足的水分和食物飼養(yǎng)8個月。

1.1.2 實驗試劑 ELISA 試劑盒購自上海西唐科技有限公司；pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 抗體購自ABclonal 公司和博士德生物公司；免疫組化試劑盒購自博士德生物公司；BeyoRTTMⅡcDNA第一鏈合成試劑盒購自碧云天生物公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒購自天根生物公司；pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 引物購自上海生工生物公司，引物序列分別為 pNF-κB（F：5'-CTGAAAAGCACCTGACAAAAGA-3'，R：5'-CTGTGTAGCCATCTGTTGAGTT-3'）、IL-1β（F：5'-TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG-3'，R：5'-AGGTCCACGGGAAAGA?CACAGG-3'）、MYOD1（F：5'-CGCCATCCGCTATATCGAGG-3'，R：5'-CTGTAGTCCATCATGCCGTCG-3'）、MYOG（F：5'-AGTGCCATCCAGTACATCGAG-3'，R：5'-AGGTTGTGGGCATCTGTAGG-3'）、β-actin（F：5'-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3'，R：5'-CAT?CACGATGCCAGTGGTA-3'）。

1.2 方法

1.2.1 物理方法測量小鼠的握力水平 簡易握力計（100 N）一端固定，另一端系在小鼠尾巴根部，誘導(dǎo)小鼠四肢緊抓鐵網(wǎng)做攀爬動作，同時記錄握力計變化，每只小鼠測量5次取平均值。

1.2.2 Hp復(fù)蘇及菌液制備 哥倫比亞固體培養(yǎng)基結(jié)合脫脂纖維羊血及混合抗生素制成血平板，細菌室溫融化后取50 μl 接種至制好的血平板，在37℃、5%O2、10%CO2、85%N2的環(huán)境下培養(yǎng)7～10 d，待細菌長滿（無色透明，針尖樣細小或融合成片，表面光滑濕潤）部分收集至1.5 ml EP 管，存于-80℃?zhèn)溆茫徊糠钟脽o菌生理鹽水刮取制成新鮮Hp 懸液用于小鼠灌胃處理。

1.2.3 小鼠灌胃及處理 將24 只小鼠平均分為4 組：對照組（M）、低濃度組（L）、中濃度組（I）、高濃度組（H），6 只/組，對照組用生理鹽水處理，濃度組分別用低濃度0.3 ml、中濃度0.6 ml、高濃度0.9 ml Hp 懸液（菌液濃度調(diào)至1×109CFU/ml）處理。連續(xù)灌胃3 周，每周1 次，距最后1 次灌胃10 周后麻醉小鼠，取小鼠新鮮血液存于-80℃?zhèn)溆茫∥附M織、腓腸肌組織、比目魚肌組織部分存于-80℃?zhèn)溆茫糠钟?%多聚甲醛液中固定。

1.2.4 ELISA 檢測IL-1β 根據(jù)雙抗體夾心法檢測小鼠血清中IL-1β 表達，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μl，將反應(yīng)板充分混勻后于37℃靜置40 min；洗滌液充分洗滌4～6次，晾干；每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μ（l空白除外），反應(yīng)板充分混勻后于37℃靜置20 min；洗板，同前；每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100 μl，反應(yīng)板于37℃靜置10 min；洗板，同前；每孔加入底物工作液100 μl，置于37℃避光反應(yīng)15 min；每孔加入100 μl終止液混勻，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.5 HE 染色 石蠟切片于65℃烤箱烤片2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各20 min，乙醇梯度脫水，蒸餾水沖洗2 次；蘇木素染色1～2 min，1%鹽酸乙醇分化1 min，蒸餾水沖洗2 次，稀氨水藍化數(shù)秒；伊紅染色1～2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。

1.2.6 免疫組化 石蠟切片于65℃烤箱烤片2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各20 min，乙醇梯度脫水，蒸餾水沖洗2次；滴加2%的H2O2，阻斷內(nèi)源性的H2O2酶，室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗3 次，再用PBS 緩沖液沖洗2次，甩去多余的液體；采用枸櫞酸鹽進行抗原修復(fù)，濕盒中孵一抗，4℃ 過夜，PBS 緩沖液沖洗3 次，甩去多余的液體，接著孵二抗，37℃孵育30 min；DAB 顯色，蘇木素染色1～2 min，1%鹽酸乙醇分化1 min，自來水沖洗后返藍數(shù)秒，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。

1.2.7 qPCR 檢測 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG的mRNA 表達 取30 mg 小鼠肌肉組織，加入1 ml Trizol 裂解液超聲破碎組織提取總RNA，酶標(biāo)儀檢測總 RNA 濃度（ng/μl）。BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，42℃孵育60 min，80℃ 孵育 10 min。SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒配置PCR 反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性15 min，95℃ 變性10 s，60℃ 退火/延伸30 s，PCR反應(yīng)循環(huán)40次。

1.2.8 Western blot 檢測 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 蛋白質(zhì)表達 取30 mg 小鼠肌肉組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液超聲破碎組織提取總蛋白，BCA 試劑盒對蛋白定量，按照40 μg/孔的蛋白量進行12%的SDS-PAGE，蛋白分離后轉(zhuǎn)至NC 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗4℃過夜，使用TBST 洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜，最后加入發(fā)光液于凝膠成像儀曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相關(guān)蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用單因素方差分析。應(yīng)用GraphPad Prism8.0 軟件進行t檢驗分析及統(tǒng)計圖形制作。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的握力水平 與對照組相比，干預(yù)組小鼠的握力明顯下降，且隨著Hp 懸液濃度的增加，小鼠握力逐漸下降，呈負相關(guān)（P<0.05、P<0.01 或P<0.001，圖1）。

圖1 物理方法測量小鼠的握力水平Fig.1 Grip strength of mice was measured by physical method

2.2 ELISA檢測小鼠血清中IL-1β表達量 采用鼠源IL-1β ELISA 試劑盒以空白孔調(diào)零檢測其450 nm處的OD 值測量表達量，結(jié)果顯示IL-1β 在低濃度組（L）、中濃度組（I）、高濃度組（H）表達量明顯高于對照組（M）（P<0.01或P<0.001），表明Hp干預(yù)小鼠一定時間后血清中的IL-1β明顯升高（圖2）。

圖2 ELISA檢測小鼠血清中IL-1β表達量Fig.2 Levels of serum IL-1β of mice was detected by ELISA

2.3 HE 染色觀察小鼠胃黏膜、小鼠腓腸肌組織、小鼠比目魚肌組織的炎癥浸潤程度及小鼠骨骼肌變化情況 與對照組相比，隨著菌液濃度增加，小鼠胃黏膜組織炎癥浸潤程度逐漸增加（圖3A）；小鼠腓腸肌組織炎癥浸潤程度增加，高濃度組出現(xiàn)玻璃樣變性，肌肉組織有衰減的表現(xiàn)（圖3B）；小鼠比目魚肌組織炎癥浸潤程度增加，肌肉組織有衰減表現(xiàn)（圖3C）。

圖3 各組小鼠HE染色結(jié)果（×200）Fig.3 Results of HE staining of mice in each group（×200）

2.4 免疫組化檢測骨骼肌組織中IL-1β、MYOG 的表達 與對照組相比，干預(yù)組（高濃度菌液組，因為高濃度菌液組對小鼠骨骼肌組織的影響變化最明顯）IL-1β 在骨骼肌組織中的表達明顯增加，MYOG在骨骼肌組織中的表達明顯減少（P<0.001）；圖4A中深棕色信號分別代表IL-1β 和MYOG 的陽性信號，淺棕色為背景顏色，圖 4B 為 IL-1β 和 MYOG 的陽性信號百分比的統(tǒng)計分析柱狀圖。

圖4 免疫組化檢測骨骼肌組織中IL-1β、MYOG表達（×200）Fig.4 Expressions of IL-1β and MYOG in skeletal mus?cle tissue detected by immunohistochemistry（×200）

2.5 qPCR 檢測小鼠肌肉組織中 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 的 mRNA 表達 與對照組相比，pNF-κB、IL-1β 表達量隨著菌液濃度的升高而增加，MYOD1、MYOG 表達量隨著菌液的濃度的升高而減少（P<0.01或P<0.001）。見圖5。

圖5 qPCR檢測小鼠肌肉組織中pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG的相對表達Fig.5 qPCR analysis of pNF-κB，IL-1β，MYOD1 and MYOG relative expressions in mice muscle tissue

2.6 Western blot 檢測小鼠肌肉組織中pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 的表達 如圖6 所示，與對照組相比，小鼠腓腸肌組織及比目魚肌組織中pNF-κB、IL-1β 蛋白的表達隨著菌液濃度的升高而增加，MYOD1、MYOG 表達量隨著菌液的濃度的升高而減少（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。

圖6 Western blot 檢測小鼠肌肉組織中 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG相對表達Fig.6 Western blot analysis of pNF-κB，IL-1β，MYOD1 and MYOG relative expression in mouse muscle tissue

3 討論

Hp是一種普遍存在的物種，在全世界50%以上人口的腸道內(nèi)定植［1］。在過去的20 年中，已經(jīng)建立了Hp 感染的實驗?zāi)Ｐ蛠硌芯考膊〉陌l(fā)病機制，使用小鼠適應(yīng)的Hp 菌株（Sidney 菌株，SS1），LEE 等［12］建立了小鼠長期高細菌定植模型。雖然Hp 被認為是非侵入性的，但由于感染，會在胃黏膜中引起廣泛的炎癥反應(yīng)，這種反應(yīng)的特點是炎癥細胞，特別是中性粒細胞的黏膜浸潤，其主要由促炎性趨化因子如IL-1β 增強表達介導(dǎo)［13-15］。本研究結(jié)果證實，Hp 感染導(dǎo)致小鼠血清中的炎癥因子增加，尤其是IL-1β的表達量增加更明顯，同時還能激活NF-κB炎癥通路，經(jīng)過信號級聯(lián)反應(yīng)，又會反過來增加IL-1β的表達。

骨骼肌的生成是一個非常復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一些轉(zhuǎn)錄因子如PAX3、PAX7、SIX1、SIX4 等是決定成肌祖細胞定向分化的關(guān)鍵上游調(diào)控因子，而成肌祖細胞的生肌決定及終末分化則由MRFs 調(diào)控［11］。在骨骼肌的生成過程中，有3 個起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族：PAX 家族、SIX 家族和MRFs家族。其中PAX家族蛋白和SIX家族蛋白在肌生成早、中期起主要作用，隨后表達量下降，MRFs 在細胞成肌決定及終末分化階段起主要作用［11］。在肌肉發(fā)育過程中，骨骼肌生成的決定階段和終末分化階段由MRFs轉(zhuǎn)錄因子嚴格調(diào)控。早在28年前就有研究表明MRFs 家族成員作為堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在非肌源性細胞中過表達時可啟動肌生成過程，促進細胞向成熟轉(zhuǎn)化及細胞的分化［16］。MYOD1 和MYOG 是成肌細胞終末分化階段的核心調(diào)控因子，對于骨骼肌的生成具有雙重調(diào)控作用，一方面作為分化調(diào)控因子參與成肌細胞的終末分化階段，另一方面也作為生肌決定因子參與成肌細胞的生肌過程［11］。本實驗通過免疫組化、qPCR、Western blot 3種方法檢測了骨骼肌組織中肌肉分化相關(guān)蛋白MYOD1 和MYOG 的表達伴隨著炎癥浸潤程度的增加而減少，從而抑制肌肉細胞的分化，引起骨骼肌衰減。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Hp 感染C57BL 小鼠可能通過介導(dǎo)IL-1β 導(dǎo)致骨骼肌衰減，其具體機制還需后期通過基因敲除和細胞實驗繼續(xù)驗證。但這一發(fā)現(xiàn)可為骨骼肌衰減的治療及預(yù)防提供新的思路。