梔子苷通過抑制NLRP3炎癥小體激活治療MRL/ lpr小鼠狼瘡性腎炎①

張清平 陳永旺 （福建醫科大學附屬泉州第一醫院，泉州362000）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種系統性自身免疫性疾病，主要影響女性健康，可導致多個器官受損，最常累及腎臟［1］。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE 常見并發癥，是導致終末期SLE 患者腎臟疾病的主要原因之一［2］。LN 與SLE 發病率相關，可導致患者終末期腎病。IL-1β 是導致 LN 進展的關鍵分子，而 NLRP3 炎癥小體激活可促進IL-1β 成熟與釋放［3］。因此探尋新的干預方法調節NLRP3 炎癥小體水平，可為LN 治療提供新思路。

梔子苷是一類環烯醚萜苷類化合物，具有抗炎、鎮痛、利膽、治療軟組織損傷及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用［4］。研究顯示，梔子苷可抑制哮喘小鼠氣道炎癥和高反應性［5］。CHEN 等［6］發現梔子苷可顯著抑制骨關節炎大鼠的炎癥因子水平。SLE 炎癥級聯中，NLRP3 炎癥小體/IL-1β 信號通路發揮重要作用［7］。因此，炎癥和自身免疫的關鍵作用引起廣泛關注。激活NLRP3/ASC/Caspase-1 驅動LN 炎癥小體，導致IL-1β 產生增加，是導致MLR/lpr小鼠腎臟損傷的主要原因，NLRP3 炎癥小體激活促進LN進展［8-9］。但梔子苷是否通過調控NLRP3炎癥小體發揮LN 保護功能尚未闡明。因此，本研究建立小鼠LN 模型，觀察梔子苷對LN 的作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 抗Caspase-1 p20、IL-1β、Pro-caspase-1、ASC、GAPDH 抗體購自 Cell Signaling Technology 公司；抗 IL-18 抗體購自 Abcam 公司；抗Pro-IL-18 抗體購自 Proteintech 公司；抗 Pro-IL-1β 抗體購自Invitrogen 公司；梔子苷（純度≥98%，貨號：HY-N0010）購自MedChemExpress 公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自國藥集團化學試劑有限公司；HE 染色試劑盒購自北京海德創業公司；IL-1β、IL-18 ELISA 檢測試劑盒購自上海藍基生物公司；dsDNA 檢測試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司；shNLRP3慢病毒購自上海吉凱公司；全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司；凝膠成像系統購自美國UVP公司。

1.1.2 實驗動物 10周齡C57BL/6 雌性小鼠20只，體重（26.5±1.5）g，純種10 周齡 MRL/lpr 雌性小鼠40 只，體重（26.5±1.6）g，均購自南京大學-南京生物醫藥研究院，合格證號：SCXK（蘇）2017-0016。（23±1）℃、（55±5）%相對濕度，12 h 循環光照飼養，給予清潔級無菌墊料、飼料和飲水，自由攝食、飲水，嚴格遵照實驗動物管理規范進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 MRL/lpr 雌性小鼠隨機分為模型組及治療組，每組20只，模型組給予等劑量0.5%CMC-Na；治療組灌胃給予梔子苷（200 mg/kg，溶于 0.5%CMC-Na 溶液）8 周［10］。20 只 C57BL/6 雌性小鼠作為對照組，給予等劑量0.5%CMC-Na。

1.2.2 尿蛋白檢測 小鼠出生12周時采用代謝籠搭配糞尿分離漏斗收集尿液，每2 周分別留取模型組及治療組小鼠尿液至20周，所有尿液標本采用雙蒸水稀釋10 倍，按照BCA 試劑盒說明書檢測樣本蛋白含量。分別加入樣本和標準品，加入BCA 工作液 200 μl，37℃ 孵育 30 min。酶標儀測定562 nm 處吸光度（A），根據標準品計算樣品蛋白濃度。

1.2.3 BUN 和Cr 水平檢測 小鼠治療8 周后取靜脈血，3 000/rmin離心10 min，取上清，AU5800全自動生化分析儀檢測各組小鼠BUN和Cr水平。

1.2.4 腎臟組織病理形態學觀察 取各組小鼠腎組織，常規沖洗，多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察腎臟組織炎癥浸潤情況。

1.2.5 ELISA 檢測各組小鼠血清抗dsDNA、IL-1β、IL-18 含量 取各組小鼠靜脈血，3 000/rmin 離心10 min，取上清。按試劑盒說明書配制梯度標準品與檢測試劑，100 μ/l孔加入樣品或對照品4℃孵育過夜，洗板，加入檢測抗體 100 μl 室溫孵育 1 h，洗板，加入HRP-Streptavidin 工作液室溫孵育45 min，洗板，加入TMB 顯色液室溫孵育30 min，洗板，50 μ/l孔加入終止液，450 nm 處讀數，繪制標準曲線，計算樣品濃度，各樣品重復2次。

1.2.6 免疫熒光檢測各組腎臟IgG 沉積情況 腹腔注射過量3%戊巴比妥鈉處死小鼠，取腎臟組織冰凍切片，滴加含10%山羊血清的PBS 室溫封閉1 h，棄血清，滴加Alexa Fluor-546 標記的IgG 抗體，放入濕盒中，37℃ 孵育30 min，PBS 沖洗，5 min×3 次，避光下甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image Pro Plus 6.0 軟件進行熒光強度分析。

1.2.7 Western blot 檢測 取各組腎組織200 mg，加入裂解液1 ml，勻漿裂解，4℃、8 000/rmin 離心15 min，取上清，定量，50 μg/孔上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（Caspase-1 p20、IL-1β、IL-18、Pro-caspase-1、ASC、GAPDH）4℃ 過夜，加辣根過氧過酶標記二抗（1∶1 000）室溫1 h，ECL 化學發光法顯色，凝膠成像系統對分析條帶。

1.2.8 NLRP3 基因沉默 小鼠尾靜脈分別注射滴度 為 1×108ml-1的 NLRP3 shRNA 和 shRNA 慢 病 毒500 μl，沉默NLRP3基因表達，48 h后可達到敲低效果，同時給予梔子苷處理8周。

1.3 統計學分析 采用SPSS18.0 軟件分析數據。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠尿蛋白含量 模型組小鼠尿蛋白含量呈時間依賴性升高（P<0.05），給予梔子苷治療后16周后尿蛋白含量較模型組顯著降低（P<0.05，表1）。

表1 各組小鼠各時間點尿蛋白水平（，n=20）Tab.1 Urine protein levels at each time point of mice in each groups（，n=20）

表1 各組小鼠各時間點尿蛋白水平（，n=20）Tab.1 Urine protein levels at each time point of mice in each groups（，n=20）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Urine protein levels Groups 20 weeks 1.04±0.03 3.48±0.261）1.95±0.141）2）16 weeks 1.06±0.03 2.62±0.211）2.21±0.151）2）12 weeks 1.02±0.03 1.82±0.151）1.81±0.101）14 weeks 1.05±0.04 1.95±0.181）1.93±0.121）18 weeks 1.03±0.05 2.93±0.251）2.04±0.161）2）Control Model Treatment

2.2 各組小鼠BUN、CRE、抗dsDNA 水平 與對照組相比，模型組小鼠血清BUN、CRE 及抗dsDNA 水平顯著升高（P<0.05），給予梔子苷治療后，血清抗BUN、CRE、抗dsDNA 水平增加得到明顯緩解，說明梔子苷可減輕小鼠腎臟損傷（圖1）。

圖1 各組小鼠血清BUN、CRE、抗dsDNA水平Fig.1 Serum BUN，CRE and anti-dsDNA levels of mice in each group

2.2 HE 染色觀察小鼠腎臟組織病理學形態 與對照組相比，模型組小鼠腎小球增生、腎小球硬化及腎小球周圍炎癥明顯加重，給予梔子苷治療后，小鼠腎臟病理學改變得到明顯緩解（圖2）。

圖2 各組小鼠腎臟組織HE染色（×400）Fig.2 Renal tissues HE staining of mice in each group（×400）

2.3 小鼠腎臟組織IgG 沉積情況及血清抗dsDNA水平 與對照組相比，模型組小鼠腎小球出現大量IgG免疫復合物沉積，熒光強度明顯增強（圖3A），給予梔子苷治療后，小鼠腎小球免疫復合物沉積情況緩解（P<0.05，圖3B）。

圖3 各組小鼠腎臟組織IgG熒光染色Fig.3 IgG fluorescent staining in renal tissues of mice in each group

2.4 梔子苷對LN 小鼠NLRP3 炎癥小體激活的影響 模型組小鼠NLRP3 炎癥小體及其下游ASC 和Pro-caspase-1 表達明顯上調，給予梔子苷治療后，小鼠腎臟組織NLRP3 炎癥小體及其下游ASC 和Pro?caspase-1 表達明顯降低（P<0.05，圖4A）。ELISA 分析各組小鼠血清IL-1β 和IL-18 產生情況，梔子苷治療組小鼠血清IL-1β和IL-18水平較模型組明顯降低，說明梔子苷治療后MRL/lpr小鼠炎癥緩解（圖4B）。

圖4 各組小鼠腎臟組織中NLRP3炎癥小體激活情況Fig.4 Activation of NLRP3 inflammasome in renal tis?sues of mice in each group

2.5 梔子苷通過NLRP3炎癥小體影響炎癥反應 Western blot 結果顯示，與 shRNA 組相比，shNLRP3處理后，小鼠腎組織NLRP3 蛋白表達明顯下調（P<0.05，圖5A）。與對照組相比，模型組腎組織Procaspase-1、Caspase-1p20、IL-1β 和 IL-18 表達明顯升高，沉默NLRP3 及梔子苷治療的MRL/lpr 小鼠中，Caspase-1p20、IL-1β 和 IL-18 表達較模型組明顯降低（P<0.05，圖5B），兩組間炎癥反應差異無統計學意義（P>0.05），提示梔子苷通過調控NLRP3抑制狼瘡腎組織炎癥反應。Pro-IL-1β、Pro-IL18 表達改變與前者相反，提示梔子苷激活NLRP3 炎癥小體后導致IL活化增加，IL前體被大量消耗。

圖5 腎組織中 Pro-caspase-1，Caspase-1p20，IL-1β，Pro-IL-1β，Pro-IL-18和IL-18蛋白表達Fig.5 Expressions of Pro-caspase-1，Caspase-1p20，IL-1β，Pro-IL-1β，Pro-IL-18 and IL-18 proteins in re?nal tissues

2.6 梔子苷通過NLRP3 影響腎臟病理變化 與對照組相比，HE染色下模型組小鼠腎小球增生、腎小球硬化，腎小球周圍炎癥明顯加重，沉默NLRP3，治療組小鼠病理緩解程度與梔子苷組無明顯差異（圖6）。

圖6 沉默NLRP3后各組腎組織HE染色（×200）Fig.6 HE staining of renal tissues after NLRP3 silencing（×200）

2.7 梔子苷通過NLRP3 影響小鼠BUN、CRE、抗dsDNA 水平 與對照組相比，模型組小鼠血清BUN、CRE 及抗dsDNA 水平明顯提高（P<0.05），沉默NLRP3 及梔子苷治療的MRL/lpr 小鼠血清抗BUN、CRE 及抗dsDNA 水平上升得到明顯緩解，且兩組間炎癥反應差異無統計學意義（P>0.05，圖7），提示梔子苷通過調控NLRP3 抑制狼瘡腎組織炎癥反應。

圖7 沉默NLRP3 后各組小鼠血清BUN，CRE，抗dsDNA水平Fig.7 Serum BUN，CRE and anti-dsDNA levels after NL?RP3 silencing of mice in each group

3 討論

盡管現有治療方法對LN 患者預后有所改善，但LN仍是導致SLE患者腎功能衰竭的主要原因［11］。目前LN 治療藥物主要為糖皮質激素和免疫抑制劑，但效果并不理想［12］。因此，開發LN 治療的新策略迫在眉睫。本研究證明梔子苷治療可改善MRL/lpr小鼠LN損傷，小鼠尿蛋白評分、BUN、CRE、抗ds?DNA 水平顯著降低，腎小球免疫復合物沉積顯著減輕。進一步探討梔子苷作用機制發現，梔子苷可顯著抑制NLRP3 炎癥小體激活，減少下游炎癥細胞因子 IL-18 和 IL-1β 產生與釋放。NLRP3 炎癥小體激活是導致LN 進展的主要原因之一。研究表明，NL?RP3 炎癥小體激活可導致IL-18 和IL-1β 產生與釋放［13］。目前認為IL-18在LN患者血液和腎組織中表達升高，且與LN嚴重程度呈正相關，升高的IL-18可激活腎組織中的T細胞，促進炎癥反應，加重腎臟損傷［14-15］。研究表明，IL-1β 有助于新月形成和炎癥細胞招募［16］。除 NLRP3 外，Caspase-1 在 LN 小鼠中也發揮重要作用。研究表明，Caspase-1 缺陷型小鼠可減緩LN 發生發展，通過抑制P2X7 受體抑制NLRP3和Caspase-1 激活，發揮保護作用［17］。本研究發現，MRL/lpr 小鼠腎臟 NLRP3 炎癥小體（NLRP3/ASC/Caspase-1）被激活，梔子苷治療可抑制NLRP3 炎癥小體激活及IL-1β 和IL-18 產生，表明梔子苷通過抑制NLRP3 活化治療LN。進一步研究NLRP3 炎癥小體是否是梔子苷治療LN 的特異靶標，沉默MRL/lpr小鼠 NLRP3 基因表達，結果顯示，shNLRP3 組 NL?RP3 炎癥小體活化被抑制，IL-1β/IL-18 產生減少。同時，梔子苷處理組IL-1β 和IL-18 表達與shNLRP3組相同，表明沉默NLRP3 基因廢除梔子苷對LN 小鼠的保護作用，證實NLRP3 炎癥小體在LN 發病機制中的作用，為靶向干預NLRP3 治療LN 提供依據。大量文獻表明免疫復合物可激活NLRP3 炎癥小體，而SLE 中巨噬細胞對先天免疫刺激反應過度，導致炎癥小體活化增強，炎癥細胞因子產生是導致疾病發生發展的重要機制。多種小鼠模型研究表明，NLRP3 炎癥小體在介導LN 中發揮重要作用。Cas?pase-1 是炎癥小體的中心酶，在SLE 模型中對Ⅰ型干擾素反應、自身抗體產生和腎炎發生發展起重要作用［18］。研究表明，梔子苷可抑制小鼠巨噬細胞和小鼠模型炎癥反應［19］。因此，梔子苷可能通過影響巨噬細胞炎癥反映干預NLRP3 炎癥小體激活，從而減輕LN 腎損傷。梔子苷已被證明具有多種生物學效應，提取自茜草科植物梔子的干燥成熟果實，其作為藥物相對安全，具有開發治療LN 藥物的潛能［4］。

綜上所述，梔子苷可通過抑制NALP3 炎癥小體激活抑制炎癥細胞浸潤、炎癥因子產生，減輕LN 腎損傷，改善小鼠預后。本研究顯示，梔子苷可緩解LN小鼠腎臟損傷，為LN治療提供了新思路，并揭示了其潛在分子機制，為梔子苷臨床應用提供基礎。