茶黃素通過調控miR-190 表達對LPS 誘導的結腸上皮細胞炎癥損傷的影響①

左靈妮 劉 康 馬曉勤 楊雅麗 （甘肅省慶陽市中醫醫院肛腸科，慶陽745000）

腸道黏膜屏障是腸道的第一道防線，不僅可以將腸道細菌與外界隔離開，還可調節營養吸收和黏膜免疫平衡［1］。腸上皮是一層單層的柱狀細胞，位于腸黏膜腔表面，腸上皮細胞的完整性是腸道黏膜屏障的重要組成部分［2-3］。在某些慢性疾病的發展過程中，腸道菌群受到外部因素（例如細菌感染）刺激時發生紊亂，導致黏膜屏障受到破壞，最終引起全身性炎癥以及代謝和腸道疾?。?］。因此，維持正常的腸道黏膜屏障對人類健康和生存至關重要。脂多糖（LPS）是一種內毒素，也是一種強促炎癥分子，作為革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，LPS主要由保守的脂質A和多糖組成［4］。目前，LPS已被證明是影響腸道黏膜屏障功能的關鍵因素。

天然產物及其衍生物越來越多地用于抵抗人類疾病。茶黃素（theaflavins，TF）是在綠茶發酵成紅茶過程中兒茶素類的酶催化氧化二聚作用形成的特征性多酚。近年來，由于茶黃素顯示出各種生理作用，如抗氧化劑、抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗病毒、抗牙周炎以及預防骨質疏松的效果，已引起越來越多的關注［5］。研究表明，茶黃素對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞氧化損傷具有保護作用［6］。在大鼠的氣道上皮細胞培養中，茶黃素可減少炎癥細胞因子釋放［7］。茶黃素對大鼠缺血性腦損傷有一定的預防作用［8］。長度為19～35 個核苷酸的微小RNA（miRNA）已被證實參與腸上皮細胞損傷過程［9］。miR-190 在LPS 誘導的BV2 細胞損傷中下調表達，過表達 miR-190 抑制 LPS 誘導的 BV2 細胞損傷［10］。miR-190 在過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導的心肌細胞損傷中低表達，上調其表達可抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡，減少乳酸脫氫酶（lactate de?hydrofenase，LDH）釋放和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量［11］。但茶黃素對 LPS 誘導的結腸上皮炎癥損傷的影響，以及這一過程是否涉及miR-190 的機制尚不清楚。在本研究中，假設茶黃素可以抵抗LPS 誘導的結腸上皮細胞損傷。為了驗證這一推測，本研究以人結腸上皮細胞株NCM460 為研究對象，結合miR-190，探討茶黃素是否可以改善LPS 誘導的炎癥狀態和凋亡變化。

1 材料與方法

1.1 材料 茶黃素（含量≥98%，成都普菲德生物公司）；人結腸上皮細胞株NCM460（美國模式菌種收集中心 ATCC）；LPS（美國 Sigma 公司）；miR-190 mimic/inhibitor 及各自陰性對照miR-NC、anti-miRNC（上海 Genepharma 公司）；Lipofectamine 2000、TRIzol 試劑、SuperScript First Strand cDNA 系統（美國Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR 試劑盒（中國上海Qiagen公司）；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（上海酶聯生物公司）；抗B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）抗體、抗Bcl-2相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶偶聯的IgG二抗（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 結腸上皮細胞NCM460 在含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640 培養基中，于37℃、5%CO2的條件下培養，常規傳代。

1.2.2 細胞分組與脂質體轉染 將對數生長期的結腸上皮細胞NCM460 分為以下幾組：Con 組（對照組，未給予藥物處理）、LPS組（給予1 mg/L LPS作用24 h［12］）、LPS+TF-L 組（給予 16 μmo/l L 茶黃素［6］和1 mg/L LPS作用24 h），LPS+TF-M組（給予32 μmo/l L茶黃素和1 mg/L LPS 作用24 h），LPS+TF-H 組（給予64 μmo/l L茶黃素和1 mg/L LPS作用24 h）、LPS+miR-NC 組（轉染miR-NC 24 h 后，給予1 mg/L LPS作用 24 h），LPS+miR-190 組（轉染 miR-190 mimic 24 h 后，給予 1 mg/L LPS 作用 24 h）、LPS+TF+antimiR-NC組（轉染anti-miR-NC 24 h后，給予64 μmo/l L茶黃素和1 mg/L LPS 作用24 h），LPS+TF+anti-miR-190組（轉染miR-190 inhibitor 24 h后，給予64 μmo/l L茶黃素和1 mg/L LPS 作用24 h）。轉染前1 d，細胞以1×105個/ml接種于6孔板，生長到70%～80%匯合時，根據制造商的方案，使用Lipofectamine 2000 轉染質粒，保持6 h。然后用RPMI1640 培養基代替轉染培養基，并在37℃下再保持24 h。

1.2.3 ELISA 檢測 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 表達 收集各組NCM460 細胞上清液，分別遵循IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA 試劑盒說明書操作步驟，測定炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達。

1.2.4 流式細胞術評估細胞凋亡 通過膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙重染色法測定結腸上皮細胞NCM460 的凋亡率。收獲不同處理的NCM460 細胞，收集 5×105個細胞，將其懸浮于500 μl 結合緩沖液 Binding Buffer 中，并依次加入 5 μl Annexin VFITC 和PI。在黑暗中孵育15 min 后，通過FACS Calibur流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.2.5 Western blot 分析Bcl-2和Bax 蛋白表達 將結腸上皮細胞NCM460在RIPA 裂解緩沖液中裂解，提取總蛋白。在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中分離40 μg 蛋白，然后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。將印跡用5%脫脂牛奶封閉1 h，并與Bcl-2、Bax、GAPDH 一抗在4℃ 孵育過夜。然后將膜用辣根過氧化物酶偶聯的IgG 二抗在室溫下再孵育2 h。蛋白條帶通過ECL Plus 檢測系統可視化。使用Image J 軟件進行圖像定量，以GAPDH為對照，分析Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）測定miR-190 表達 經過不同處理后，收集細胞，TRIzol 試劑提取總RNA。根據說明書，使用SuperScript First Strand cDNA 系統將 2 μg 總 RNA 反轉錄為 cDNA。將該cDNA 用作模板并進行定量PCR。采用SYBR Green PCR 試劑盒在ABI PRISM 7700系統上進行定量分析。用 2-ΔΔCt法計算 miR-190 表達，U6 用作內部對 照 。 miR-190 和 U6 引 物 序 列 參 照 SUN 等［13］的報道。

1.3 統計學分析 使用SPSS22.0軟件分析統計數據信息。所有數據均顯示為。兩組間數據的比較采用t檢驗，多組數據間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 茶黃素對LPS 誘導的結腸上皮細胞炎癥因子表達的影響 圖1 結果顯示，與Con 組比較，LPS 組結腸上皮細胞 NCM460 中炎癥因子 IL-6、IL-1β 和TNF-α表達水平顯著升高；與LPS組比較，LPS+TF-L組、LPS+TF-M 組和LPS+TF-H 組明顯降低結腸上皮細胞 NCM460 中炎癥因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表達水平，且隨茶黃素濃度的增加，3 種炎癥因子的表達逐漸降低（P<0.05）。

圖1 茶黃素對LPS 誘導的結腸上皮細胞炎癥因子表達的影響Fig.1 Effect of theaflavins to LPS-induced colon epithelial inflammatory factor expression

2.2 茶黃素對LPS 誘導的結腸上皮細胞凋亡的影響 圖2 結果顯示，與Con 組比較，LPS 組結腸上皮細胞NCM460 的凋亡率明顯增加，Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低，Bax 蛋白表達水平明顯升高；與LPS 組比較，LPS+TF-L 組、LPS+TF-M 組和 LPS+TF-H 組結腸上皮細胞NCM460 的凋亡率明顯減少，提高Bcl-2蛋白表達水平，降低Bax蛋白表達水平，且隨茶黃素濃度的增加，細胞凋亡率和Bax蛋白表達逐漸降低，Bcl-2蛋白表達漸漸升高（P<0.05）。

圖2 茶黃素對LPS誘導的結腸上皮細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of theaflavins on apoptosis of colonic epithelial cells induced by LPS

2.3 茶黃素對LPS 誘導的結腸上皮細胞中miR-190表達的影響 圖3結果顯示，與Con組比較，LPS組結腸上皮細胞NCM460 中miR-190 表達水平顯著降低；與 LPS 組比較，LPS+TF-L 組、LPS+TF-M 組和LPS+TF-H 組明顯提高結腸上皮細胞NCM460 中miR-190 的表達水平，且隨茶黃素濃度的增加，miR-190的表達逐漸增強（P<0.05）。

圖3 茶黃素對LPS 誘導的結腸上皮細胞中miR-190 表達的影響Fig.3 Effects of theaflavins on expression of miR-190 in colonic epithelial cells induced by LPS

2.4 miR-190 過表達對LPS 誘導的結腸上皮細胞炎癥因子表達的影響 圖4 結果表明，與LPS+miRNC 組比較，LPS+miR-190 組結腸上皮細胞NCM460內miR-190 表達量明顯增加，炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達水平明顯降低（P<0.05）。

圖4 miR-190過表達對LPS誘導的結腸上皮細胞炎癥因子表達的影響Fig.4 Effect of miR-190 overexpression on expression of colonic epithelial inflammatory factors induced by LPS

2.5 miR-190 過表達對LPS 誘導的結腸上皮細胞凋亡的影響 圖5 結果發現，與LPS+miR-NC 組比較，LPS+miR-190 組結腸上皮細胞NCM460 的細胞凋亡率明顯減少，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，Bax蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。

圖5 miR-190過表達對LPS誘導的結腸上皮細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-190 overexpression on apoptosis of colonic epithelial cells induced by LPS

2.6 抑制miR-190 表達逆轉了茶黃素（64 μmol/L）對LPS 誘導的結腸上皮細胞炎癥損傷的作用 圖6結果顯示，與LPS+TF+anti-miR-NC 組比較，LPS+TF+anti-miR-190 組明顯降低結腸上皮細胞NCM460中 miR-190 表達，顯著提高炎癥因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達水平和細胞凋亡率，并明顯降低Bcl-2蛋白表達水平，顯著提高Bax蛋白表達水平（P<0.05）。

圖6 抑制miR-190 表達逆轉了茶黃素對LPS 誘導的結腸上皮細胞炎癥損傷的作用Fig.6 Inhibition of miR-190 expression reversed effect of theaflavins on LPS induced inflammatory injury of colonic epithelial cells

3 討論

LPS 是強大的細菌致病因子，當腸道環境紊亂時，LPS 可通過脫落或細菌裂解從細菌細胞壁釋放出來，并作為腸道炎癥反應的有效激活劑，影響腸道上皮細胞功能［13］。為了治療腸道疾病并減輕患者的痛苦，研究人員正在尋找抗LPS 的有效天然產物。茶黃素是紅茶中存在的主要活性多酚，包括茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3′-沒食子酸酯和茶黃素-3-3′-沒食子酸酯，具有顯著的抗炎效果［14-15］。因此，本研究試圖探討茶黃素對LPS 感染過程中結腸上皮細胞的保護作用和分子機制。

當前的研究通過評估與炎癥和凋亡狀態有關的生物學指標，探討了茶黃素對LPS 誘導的結腸上皮細胞損傷的保護作用。既往研究表明，LPS 會誘導促炎癥細胞因子表達并最終引起炎癥［16］。TNF-α是一種細胞信號蛋白（細胞因子），可誘導凋亡性細胞死亡和炎癥，TNF-α表達失調與多種疾病有關，主要在腸道中引起炎癥性腸?。?］。IL-1β、IL-6 是與炎癥相關的關鍵介質。資料顯示，茶黃素給藥減少了LPS 處理的小鼠中 TNF-α 和 IL-1β 含量，并抑制經LPS 處理的人小膠質細胞中促炎細胞因子TNF-α 的產生，從而抑制活化的小膠質細胞的神經毒性作用［17］。茶黃素可減少大鼠結扎誘導的實驗性牙周炎中IL-6 的分泌［18］。與這些研究一致，本實驗的數據顯示，LPS 處理24 h 后顯著提高了結腸上皮細胞炎癥因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 表達。而細胞給予16 μmo/l L、32 μmo/l L、64 μmo/l L 的茶黃素處理后，LPS 誘導的促炎因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表達被抑制，且這種抑制作用隨茶黃素作用濃度的增加而逐漸提高。這些結果表明，茶黃素在對抗LPS誘導的腸上皮細胞炎癥反應方面具有良好的潛力。

大量研究已證實，LPS 可誘導炎癥反應，甚至誘導細胞凋亡和自噬［19-21］。凋亡是程序性細胞死亡的一種形式，對正常細胞存活十分重要。凋亡是一個活躍的過程，涉及許多基因的激活、表達和調控［22］。Bcl-2 和Bax 屬于Bcl-2 基因家族，在細胞凋亡中起關鍵作用。Bcl-2成員位于線粒體中，具有促凋亡功能（Bax）或抗凋亡功能（Bcl-2）［23］。先前的研究表明，LPS 誘導的組織損傷（如腸道損傷）伴隨著凋亡細胞的增加［24］。茶黃素處理下調了胃黏膜上皮細胞GES-1 中乙醇損傷誘導的Bax 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）表達水平，上調Bcl-2 表達水平，可以通過調節細胞凋亡來保護GES-1細胞免于乙醇損傷［25］。本實驗數據表明，LPS刺激24 h可顯著增加細胞凋亡率。LPS顯著上調結腸上皮細胞中Bax 蛋白表達，下調Bcl-2 蛋白表達，而茶黃素則抵消了這些LPS誘導的效果。提示茶黃素通過抑制促凋亡蛋白Bax 表達，促進抗凋亡蛋白Bcl-2 表達而減弱LPS 誘導的結腸上皮細胞凋亡，與前人報道相符［23］。為了探索茶黃素對抗LPS的潛在機制，本研究觀察到不同濃度的茶黃素可以促進miR-190 表達，且促進作用隨茶黃素濃度的增加而逐漸增強。提示茶黃素對LPS損傷的結腸上皮細胞的治療作用與其調節miR-190基因的能力有關。

同時，本實驗發現LPS 可下調miR-190 表達。在不同癌癥中，miR-190 的作用已得到廣泛探討［26-28］。最近的研究表明，miR-190 影響心臟缺血/再灌注和帕金森病［10-11］。目前尚未建立miR-190 與非癌性結腸疾病之間的關系。因此，這項研究應用了不同的miR-190 質粒來幫助理解miR-190 在LPS誘導的炎癥和凋亡損傷中的作用。據報道，在LPS誘導的 BV2 細胞中，miR-190 下調；當 miR-190 過表達時，LPS 誘導的BV2 細胞中促炎介質（如iNOS、IL-6、TNF-α 和TGF-β1）的表達受到抑制，抗炎性介質（如IL-10）增加，且miR-190 的上調抑制了LPS 誘導的BV2 細胞凋亡［10］。這一結果與本項研究結果相符，一方面，miR-190 過表達可抑制LPS 誘導的結腸上皮細胞中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達，另一方面，miR-190 過表達降低LPS 誘導的結腸上皮細胞凋亡率、Bax 蛋白表達，并顯著提高Bcl-2 蛋白表達水平。這表明miR-190 過表達可減輕LPS 誘導的結腸上皮細胞炎癥反應和凋亡，從而發揮一定的保護作用。此外，抑制miR-190表達后，茶黃素抑制LPS 誘導的結腸上皮細胞中 IL-6、IL-1β、TNF-α 表達、細胞凋亡率、Bax蛋白表達的作用，以及促進Bcl-2蛋白表達的作用被逆轉。這些結果說明，茶黃素保護結腸上皮細胞免受LPS 損傷的功能機制與調控miR-190有關。

總之，本研究的結果強調了茶黃素是改善結腸上皮細胞損傷的有效天然產物。由于其顯著的抗炎和抗凋亡能力，茶黃素有效地保護結腸上皮細胞免受LPS 誘導的傷害。并且，茶黃素的功能是通過調控細胞中miR-190的表達來實現的。以上結果表明，茶黃素可能是預防與LPS 相關的腸道疾病的有效治療劑。