基于IL-6/STAT3信號通路觀察姜黃素對炎癥相關性結直腸癌的影響

邱敏霞 孔燦燦 陳文妹 趙心愷 （海南省人民醫院內鏡診療中心，海口570311）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）作為一種特發性腸道炎癥性疾病，累及回腸、直腸和結腸，以腹痛、腹瀉為主要臨床表現，嚴重者會出現血便。潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是IBD的主要類型，我國UC 的發病率呈逐年上升的趨勢［1］。UC 的機制尚不清楚，目前認為主要與環境、遺傳、感染及免疫有關，其中腸黏膜免疫系統異常在UC 發病中發揮重要作用［2］。大量研究提示UC是結直腸癌（colorectal cancer，CRC）發生的危險因素，因其發病機制與散發型CRC 有所不同，故這種由結腸炎癥演變的CRC 又稱為炎癥相關結直腸癌（colitis-associated CRC，CAC）［3］。多種白細胞介素介導的炎癥反應參與UC 的癌變過程，有報道稱，白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcrip?tion 3，STAT3）通路在細胞生理活動中發揮重要作用，且已被證實與癌癥有關［4］。研究發現，CAC 患者血清及癌組織中IL-6 水平明顯升高，進一步分析發現與腫瘤轉移及預后生存率明顯相關［5］。STAT3 作為IL-6 信號通路下游關鍵調節因子，在CAC 大鼠中持續激活，甚至有學者認為STAT3屬于致癌基因［6］。姜黃素（curcumin，CUR）是從姜黃根莖中提取的多酚類物質，近年來研究發現，CUR 可以調節多個信號通路，具有廣泛的藥理作用［7］。研究表明，CUR 影響腸上皮癌細胞的增殖、分化、凋亡，此外還可調節胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）等多種癌癥相關的信號通路［8］。本研究旨在從IL-6/STAT3信號通路揭示CUR對CAC的干預作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SYXK（京）2017-0033），體重為（20±2）g，飼養于本院動物實驗中心，飼養室保持良好通風，飼養溫度為（25±2）℃，濕度（50±10）%，12 h 循環光照。正常飼養1 周以適應環境，第2周開始進行實驗，所有動物均在本實驗室SPF 級動物房飼養，動物的使用及操作按照本院動物管理委員會（IACUC2018-012）的規定執行，并在不影響實驗要求和結果基礎上，按照3R 原則給予人道主義關懷。

1.1.2 藥品與主要試劑 CUR（批號：938900296）購自南京澤郎生物醫藥有限公司；氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）（批號：17029838）、反轉錄試劑盒（批號：52-0394）購自美國Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）（批號：01837473）購自美國 MP Bio 公司；TNF-α（批號：18203094）、IL-1β（批號：18162994）、IL-4（批號：18209388）和IL-10（批號：18129012）ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物公司；Trizol 試劑盒（批號：JZ298312）購自日本TaKaRa 公司；全蛋白抽提試劑盒（批號：W2130934）購自德國QIAGEN 公司；Western blot 試劑盒（批號：838773321）購自美國 BD 公司；IL-6（批號：ER37-466612）、STAT3（批號：AM3778934）、p-STAT3 抗體（批號：SA3818934）購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及分組 按照參考文獻的方法構建模型［9］，取 33 只雄性昆明大鼠自由飲用2%DSS水溶液共7 d；之后普通飲用水14 d。隨機選取3 只大鼠取結腸組織進行病理學檢查，按照YAS?SIN 等［10］的方法證實模型構建成功，將剩下的 30 只大鼠隨機分為模型（Model）組、CUR 低劑量（Low dose）組和CUR 高劑量（High dose）組，另取10 只大鼠21 d 始終給予普通飲用水作為對照（Control）組。CUR 低劑量組、CUR 高劑量組自造模第1 天開始分別灌胃給予15 mg/kg、30 mg/kg 的CUR（溶于花生油），灌胃劑量2 ml，連續給藥7 d，以該7 d 作為1 個循環，共進行4 個循環。對照組和模型組給予等體積花生油灌胃處理。分別將第7、14、21、28 天計為1 個循環最后1 d 稱重。實驗結束2 d 后大鼠斷頸處死。取出結腸組織，判斷觀察成瘤數量，用游標卡尺測定腫瘤平均直徑，計算瘤負荷（即所有腫瘤的平均直徑之和），以直徑D≥1 mm 作為成瘤標準。生理鹽水沖洗后一半放于4%多聚甲醛溶液固定，另一半存儲于-80℃冰箱備用。

1.2.2 HE 染色檢測大鼠結腸組織形態 結直腸組織在多聚甲醛中浸泡48 h 后，經脫水、常規石蠟包埋，切成4 μm的切片。然后依次脫蠟、水化，進行HE 染色、脫水、二甲苯充分浸泡2 h 直至透明后干燥。用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態并拍攝。

1.2.3 ELISA 檢測大鼠結直腸組織勻漿液上清中炎癥因子含量 取各組大鼠結直腸組織制成勻漿，4 000/rmin 離心15 min，取上清液為待測樣本。ELISA 試劑盒測定 TNF-α、IL-1β、IL-4 和 IL-10 的含量，具體操作步驟依照試劑盒說明書進行。反應終止后，采用酶標儀測量450 nm 處的OD值。

1.2.4 免疫組化檢測大鼠結直腸組織上皮鈣黏素（epithelia calcium，E-cadherin）和 Vimentin 的表達 組織切片常規脫蠟和水化后置于PBS緩沖液中高壓修復，然后用3%雙氧水室溫下浸泡以阻斷內源性過氧化物酶，封閉，分別加稀釋好的一抗4℃過夜孵育，次日復溫后PBS洗滌干凈，分別加稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌。加適量DAB 孵育5 min，去離子水終止反應，蘇木素復染5 mim，無菌水沖洗后，依次用不同濃度梯度乙醇脫水2 h，無菌濾紙吸凈表面殘存液體，二甲苯透明，用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態并拍攝。參照文獻方法進行評估，每張切片隨機選取5 個高倍鏡視野（×200）在光鏡下連續觀察10個視野，每個視野內計數200個細胞中陽性細胞數，染色強度計分依據：按照無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色順序分別計0 分、1 分、2 分、3 分。陽性細胞數計分：按照無陽性細胞、陽性細胞<25%、陽性細胞26%～50%、陽性細胞51%～75%、陽性細胞>75%分別記0分、1分、2分、3分以及4分。以上兩項計分相加后作為評判結果，最低0分，最高7分。

1.2.5 RT-qPCR 檢測大鼠結直腸組織mRNA 的表達 依據Trizol 法提取各組樣本的總RNA，使用引物如下：H19（上游：5'-ACCTGGAGCAAGCCATTAGCC-3'，下游：5'-CGGACCGCATTCAAGTCATAGT-3'）；let-7a（上 游 ：5'-GCAACCATTAGCCGCCATTAG-3'，下游：5'-CAAGTCATCGGACCGCATTAGT-3'）；c-Myc?mRNA（上游：5'-AAGCCATAAGCCGAGCTTCAAGCC-3'，下游：5'-CGGACCGCAGTCATATAACCTG?GT-3'）；高遷移率族蛋白A2（high mobility group pro?teinA2，HMGA2 mRNA）（上游：5'-ACATTAGCCG?GACTGCCGCAA-3'，下游：5'-ACATCGGTCAGTCAACGCTAGT-3'）。反應條件：75℃ 預變性 2 min，進入以下循環90℃變性5 min；60℃退火60 s；72℃延伸 30 s；共 40 個循環。相對表達量用 2-ΔΔCt表示。每個樣本獨立重復實驗3次。

1.2.6 Western blot 檢測大鼠結直腸組織IL-6/STAT3 通路蛋白表達 分別收集各組樣本，用總蛋白提取試劑盒提取組織勻漿中總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。制備蛋白樣品并進行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后轉至PVDF 膜，加含有5%BSA 的封閉液室溫下封閉2 h。加入適宜濃度一抗于4℃封閉過夜。次日用緩沖液清洗PVDF膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h后，加入顯色液曝光顯影。

1.3 統計學分析 數據統計采用SPSS19.0 軟件，作圖工具采用Graphpad 5.01，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 CUR 對體重的影響 造模期間，Model 組大鼠先后出現精神萎靡、活動量減少、毛澤無光、進食減少等現象，個別出現便血；給予CUR 治療的大鼠活動量及飲食量增加，便血癥狀消失。與Control 組相比，Model 組大鼠在第7 天起至第21 天體重增加明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05）；與Model組相比 Low、High dose 組大鼠第 7 天起至第 21 天體重升高明顯，High dose 組大鼠體重升高更加明顯，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖1。

圖1 CUR對CAC大鼠體重的影響Fig.1 Influence of CUR on weight of CAC rats

2.2 CUR 對大鼠結直腸組織形態的影響 觀察大鼠結腸組織外觀，如圖2，Control 組外觀正常，黏膜完整光滑，未見組織增生；Model 組結腸組織出現肉眼可見的組織增生，且有腫瘤產生（P<0.05）；與Model組相比，Low dose組結腸組織增生和腫瘤明顯減少，High dose 組腫瘤減少更為明顯（P<0.01）。鏡下觀察各組大鼠結腸組織HE 染色病理切片，Con?trol 組大鼠結腸組織黏膜完整，腺體結構整齊，黏膜下未見炎癥；Model 組部分結腸明顯充血，大部分結腸黏膜內細胞排列紊亂，炎癥細胞浸潤組織，代替正常細胞，腸腺出現潰瘍，失去結腸腺體及肌層的正常結構；與Model 組相比，Low dose 組炎癥浸潤減少，黏膜層和肌層損傷減輕，High dose 組炎癥浸潤明顯減少，腺體結構較為完整。

圖2 CUR對大鼠結直腸組織形態的影響Fig.2 Influence of CUR on colorectal tissue morphology in rats

2.3 TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10在大鼠組織勻漿液上清中的表達變化 與Control 組相比，Model 組TNF-α、IL-1β 表達水平升高，IL-4、IL-10 表達水平下降，差異有統計學意義（P<0.05）。與Model組相比，Low dose、High dose 組 TNF-α、IL-1β 表達水平均有不同程度下降，IL-4、IL-10 表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），且High dose組變化更明顯（P<0.01），見圖3。

圖3 TNF-α、IL-1β、IL-4 和 IL-10 在大鼠組織勻漿液上清中的表達變化Fig.3 Expression of TNF-α，IL-1β，IL-4 and IL-10 in rat tissue homogenate supernatant

2.4 RT-qPCR 檢測 H19、let-7a、c-Myc mRNA、HM?GA2 mRNA 的表達 與 Control 組相比，Model 組中H19、c-Myc mRNA、HMGA2 mRNA 表達明顯上升，let-7a 表達明顯下降，差異均具有統計學意義（P<0.05）；與 Model 組相比，Low dose、High dose 組中H19、c-Myc mRNA、HMGA2 mRNA 表達明顯下降，let-7a 表達明顯升高（P<0.05），且High dose 組變化更明顯，差異均具有統計學意義（P<0.01），見圖4。

圖4 H19、let-7a、c-Myc mRNA、HMGA2 mRNA 大鼠組織勻漿液上清中的表達變化Fig.4 Expression changes of H19，let-7a，c-Myc mRNA，HMGA2 mRNA in rat tissue homogenate superna?tant

2.5 免疫組化檢測E-cadherin、Vimentin 在大鼠結腸組織中的表達變化 見圖5，與Control 組相比，Model 組中E-cadherin 蛋白表達評分明顯降低，Vi?mentin 蛋白表達評分明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與 Model 組相比，Low dose、High dose 組E-cadherin 蛋白表達評分明顯升高，Vimentin 蛋白表達評分明顯下降（P<0.05），且High dose組下降水平更明顯，差異有統計學意義（P<0.01）。

圖5 E-cadherin、Vimentin在大鼠結腸組織中的表達變化Fig.5 Expression changes of E-cadherin and Vimentin in colon tissues of rats

2.6 IL-6/STAT3 通路蛋白在大鼠結腸組織中的表達變化 與Control 組相比，Model 組中IL-6 和p-STAT3 蛋白表達水平顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）；與 Model 組相比，Low dose、High dose組IL-6 和p-STAT3 蛋白表達水平均下降（P<0.05），且High dose 組下降水平更顯著，差異具有統計學意義（P<0.01），各組大鼠結腸組織中STAT3 蛋白差異無統計學意義（P>0.05），見圖6。

圖6 IL-6、STAT3、p-STAT3 蛋白在大鼠結腸組織中的表達變化Fig.6 Expression changes of IL-6，STAT3 and p-STAT3 proteins in colon tissues of rats

3 討論

CRC 是世界范圍內發病率位居第三的惡性腫瘤，僅次于肺癌和乳腺癌，UC 患者是CRC 的高發人群，隨著病程的延長，癌變風險明顯增加。盡管CAC 只占CRC 病例的2%，但在CRC 死亡患者中占20%左右［11］。CAC 的發病是一個涉及多基因、多步驟的復雜過程。以往流行病學數據和臨床研究表明，補充 CUR 或者升高血清 25（OH）D 水平對于CAC 具有一定的預防作用［12］。研究發現［13］，CUR 可以有效降低結腸炎癥小鼠的炎癥水平并對CAC 形成保護作用，但其作用機制尚未闡明。因此本研究探討CUR 對CAC 的療效及其相關的分子機制。本研究首先成功構建大鼠CAC 模型，并于一段時間后給予CUR 治療，發現與未獲得治療的大鼠相比，CUR 治療后的大鼠精神狀態、活動、飲食等情況均明顯好轉，觀察期內體重在治療后也逐步增長。取大鼠結腸組織，發現與模型組相比，CUR 各組大鼠結腸腫瘤數量均明顯減少；HE 染色切片觀察炎癥浸潤明顯減少，病變減輕，且CUR 高劑量組更加明顯，證明CUR對CAC大鼠具有較好的保護作用。

在腫瘤發生、發展的各個階段伴隨的慢性炎癥均會產生細胞因子的釋放［14］。IL-6/STAT3 是細胞內介導炎癥信號轉導的重要通路，其可介導促炎細胞因子TNF-α、IL-1β 和抑炎細胞因子 IL-4、IL-10 等多種炎癥因子的產生，而炎癥因子之間的平衡失調會導致腫瘤的發生［15］。研究顯示，TNF-α 是重要的炎癥遞質，介導局部炎癥反應并可導致器官或多系統受損［16-17］。IL-1β 具有較強的促炎活性，在促進多種炎癥細胞向腸黏膜趨化浸潤中發揮重要作用，是腸黏膜上皮的損害的重要因素［18］。IL-4 和 IL-10 在炎癥疾病中均為有效的抗炎物質，能夠保護機體出現過度病理反應。有研究表明，IL-4和IL-10能夠通過下調炎癥介質TNF-α和IL-6的表達促進機體體液免疫反應，并且IL-4、IL-10 可在直腸炎中共同作用逆轉Th1/Th2 細胞活化過程，進而改善黏膜修復［19］。本研究發現給予 CUR 治療后，TNF-α、IL-1β表達水平均有不同程度的下降，高劑量組下降更為顯著，而抑炎因子IL-4、IL-10 的表達水平明顯升高。該研究結果提示 TNF-α、IL-1β、IL-4 和 IL-10 參與CAC 的發病與免疫過程，而CUR 能夠較好地調節TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的表達，從而發揮對CAC的治療作用。

IL-6 的高表達可以促進STAT3 持續磷酸化，激活后的p-STAT3具有較強抑制細胞凋亡并促進細胞增殖的作用［20］。研究發現，p-STAT3 可轉位至細胞核發揮對靶基因的調控作用，其中c-Myc是p-STAT3的靶基因之一，也是一個重要的原癌基因，參與了細胞周期的調控作用，c-Myc 的高表達可導致細胞增殖，最終誘發癌變［21］。c-Myc 可作為轉錄因子與H19啟動子結合，調控H19的表達，而H19被證明可通過多種作用調控腫瘤細胞的增殖，在CRC 細胞中，H19 可下調微小 RNA let-7a 的表達，let-7a 在哺乳動物中可以調節細胞周期而參與細胞增殖的調控作用［22］。有研究發現，let-7a 過表達后，結腸癌細胞增殖明顯受到抑制，提示了let-7a 對結直腸癌腫瘤具有抑制作用［23］。本研究中，模型組大鼠c-Myc和H19表達水平明顯升高，let-7明顯降低，提示CAC大鼠的發病與三種基因的表達有關。另有報道稱，let-7a 下調后對下游靶蛋白HMGA2 抑制作用減弱明顯，而HMGA2是介導EMT的重要環節，EMT是指上皮細胞轉化為間質細胞的生物學行為，在胚胎形成、器官發育、組織再生和腫瘤轉移過程中起到重要的作用［24］。在腫瘤進展中，分別代表上皮細胞和間質細胞的標記物E-cadherin 和Vimentin 的異常表達可以反映出腫瘤細胞的侵襲能力、藥物敏感性和抗凋亡能力的變化，且已有研究證實，EMT 促進CAC 的發生、發展和轉移［25］。除上述推測的 EMT 機制外，多種參與炎癥的細胞因子在EMT 介導的CAC中亦發揮著關鍵作用［26］。本研究中，模型組大鼠IL-6、p-STAT3 蛋白，HMGA2 mRNA 及 Vimentin 蛋白表達評分明顯升高，E-cadherin 蛋白表達評分明顯下降，而經 CUR 治療后 IL-6、p-STAT3 蛋白，HMGA2 mRNA 及Vimentin 蛋白表達評分明顯降低，E-cad?herin 蛋白表達評分明顯升高，且高劑量組變化更明顯。說明CUR 可能通過IL-6/STAT3 信號通路調控EMT機制發揮對CAC大鼠的保護作用。

綜上所述，CUR 對大鼠CAC 形成具有保護作用，其機制可能與IL-6/STAT3 信號通路的調控，降低炎癥反應及抑制EMT的發生有關。