哈巴苷通過抑制miR-1246表達對LPS誘導的人牙周膜細胞損傷的影響

吳 源 高 鵬 李海濤 （青海紅十字醫院口腔科，西寧810000）

牙周病是常見的口腔疾病，人牙周膜細胞（hu?man periodontal ligament cells，hPDLCs）是牙周結締組織中重要的間質細胞，在牙周組織的增殖中起重要作用，hPDLCs損傷可分泌多種細胞因子影響牙周病的發生；而脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是公認的炎癥啟動因子［1-2］。哈巴苷是玄參中的主要成分，具有抗氧化及保護細胞免受損傷的作用，如哈巴苷能通過抑制氧化應激抑制心肌細胞H9c2 凋亡［3］。哈巴苷可通過激活 Wnt/β-catenin 信號傳導途徑來減輕大鼠脊髓損傷后神經元凋亡并促進軸突再生［4］。哈巴苷可通過激活PI3K/Akt信號通路改善 Aβ25-35 誘導的 PC12 細胞毒性［5］。然而哈巴苷對hPDLCs 損傷的影響及機制尚不清楚。研究報道miR-1246 過表達加劇了LPS 誘導的軟骨細胞活力下降，細胞凋亡增加和促炎因子的過度產生［6］。miR-1246 在LPS 誘導的肺動脈內皮細胞損傷中高表達，干擾其表達可抑制LPS 誘導的細胞凋亡和炎癥因子 IL-1β 和 TNF-α 的釋放［7］。但 miR-1246 對LPS誘導hPDLCs損傷的影響，以及哈巴苷是否通過調控miR-1246 的表達影響LPS 誘導的hPDLCs 損傷目前還尚未可知。因此，本實驗旨在研究哈巴苷是否通過調控miR-1246 的表達影響LPS 誘導的hP?DLCs損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 hPDLCs（貨號：RC-CELL-0185，上海諾辰生物技術有限公司）；DMEM 培養液（貨號：319-005-CL，北京泰澤嘉業科技發展有限公司）；哈巴苷（貨號：111728，上海雅吉生物科技有限公司）；脂多糖（貨號：L2880，美國Sigma 公司）；TNF-α 酶聯免疫吸附試劑盒（貨號：E-EL-H0109c，武漢巴菲爾生物技術服務有限公司）、IL-1β 酶聯免疫吸附試劑盒（貨號：E-EL-H0149c，武漢巴菲爾生物技術服務有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（貨號：P-CA-201，武漢益普生物科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（貨號：QCB-3201-1，上海欽誠生物科技有限公司）；BCA 試劑盒（貨號：23227，北京諾博萊德科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組 hPDLCs用含20%胎牛血清的DMEM 培養液培養，取第3代細胞，用10 μg/ml LPS 處理作為 LPS 組，分別用濃度為 20 μmo/l L、40 μmo/l L、80 μmo/l L 的哈巴苷和 10 μg/ml LPS 處理，作為哈巴苷低、中、高濃度組，不做處理的為Con組；將 anti-miR-NC、anti-miR-1246 轉染至 hPDLCs 后用 10 μg/ml LPS 處理，記為 LPS+anti-miR-NC 組、LPS+anti-miR-1246 組 ；miR-NC、miR-1246 轉 染 至hPDLCs后用80 μmo/l L的哈巴苷和10 μg/ml LPS處理，記為LPS+HG+miR-NC組、LPS+HG+miR-1246組。

1.2.2 ELISA 檢測TNF-α、IL-1β 水平 取1.2.1各組細胞培養上清，具體按照試劑盒操作進行檢測。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組細胞，洗滌后用結合緩沖液重懸，加入10 μl 的Annexin V-FITC 和5 μl 的PI，混勻，避光孵育 10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達 用RIPA 蛋白裂解液提取細胞總蛋白，再用BCA 試劑盒進行定量。蛋白樣品變性后進行SDS-PAGE，轉至PVDF上，脫脂牛奶封閉后加入相應的一抗，4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，加入電化學發光液顯影，定影成像后分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.2.5 RT-qPCR 檢測miR-1246 表達水平 提取細胞總 RNA，反轉錄成 cDNA，miR-1246 以U6 為內參進行 PCR 擴增，相對表達量用 2-ΔΔCt法計算。miR-1246 上游引物序列：5'-AATGGATTTTTGGAGCAGG-3'，下游引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCA?CA-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTT?GCGT-3'。

1.3 統計學分析 用SPSS20.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料用表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs炎癥因子表達的影響 與 Con 組比較，LPS 組 hPDLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平升高（P<0.05）；與 LPS 組比較，哈巴苷低、中、高濃度組hPDLCs中TNF-α、IL-1β水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05，表1）。

表1 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 炎癥因子表達的影響（，ng/ml，n=9）Tab.1 Effect of harpagide on expression of inflammatory factors in human periodontal ligament cells in?duced by LPS（，ng/ml，n=9）

表1 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 炎癥因子表達的影響（，ng/ml，n=9）Tab.1 Effect of harpagide on expression of inflammatory factors in human periodontal ligament cells in?duced by LPS（，ng/ml，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com?pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

IL-1β 2.39±0.22 13.19±1.071）9.69±0.862）6.32±0.512）3）3.33±0.232）3）4）404.409 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P TNF-α 4.22±0.37 9.88±0.621）7.88±0.482）6.23±0.282）3）5.04±0.232）3）4）262.702 0.000

2.2 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs凋亡的影響 與Con 組比較，LPS 組 hPDLCs 凋亡率升高，Bcl-2 表達水平降低，Bax 表達水平升高（P<0.05）；與LPS 組比較，哈巴苷低、中、高濃度組hPDLCs凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax 表達水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05，圖1、表2）。

表2 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs（，n=9）

表2 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com?pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

Bax protein 0.28±0.02 0.74±0.051）0.61±0.052）0.47±0.032）3）0.34±0.032）3）4）224.823 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P Apoptosis rate（%）6.17±0.57 26.82±2.191）20.01±1.582）16.05±1.312）3）9.52±0.612）3）4）314.546 0.000 Bcl-2 protein 0.62±0.04 0.12±0.021）0.25±0.022）0.37±0.032）3）0.53±0.042）3）4）378.092 0.000

圖1 哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs凋亡的影響Fig.1 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs

2.3 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 中miR-1246 表達的影響 與Con 組比較，LPS 組miR-1246 表達水平升高（P<0.05）；與LPS 組比較，哈巴苷低、中、高濃度組miR-1246 表達水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05，表3）。

表3 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 中miR-1246 表達的影響（，n=9）Tab.3 Effect of harpagide on expression of miR-1246 in hPDLCs induced by LPS（，n=9）

表3 哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 中miR-1246 表達的影響（，n=9）Tab.3 Effect of harpagide on expression of miR-1246 in hPDLCs induced by LPS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com?pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

miR-1246 1.00±0.07 3.22±0.271）2.48±0.212）1.89±0.162）3）1.38±0.132）3）4）213.170 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P

2.4 抑制 miR-1246 表達對 LPS 誘導的 hPDLCs 炎癥因子表達的影響 與LPS+anti-miR-NC 組比較，LPS+anti-miR-1246 組 miR-1246 表達水平及 TNF-α、IL-1β水平降低（P<0.05，表4）。

表4 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.4 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on ex?pression of inflammatory factors in hPDLCs in?duced by LPS（，n=9）

表4 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.4 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on ex?pression of inflammatory factors in hPDLCs in?duced by LPS（，n=9）

Note：Compared with LPS+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

IL-1β（ng/ml）13.64±1.23 4.37±0.351）21.746 0.000 Groups LPS+anti-miR-NC LPS+anti-miR-1246 t P miR-1246 1.00±0.05 0.28±0.031）37.044 0.000 TNF-α（ng/ml）9.92±0.57 5.75±0.371）18.409 0.000

2.5 抑制 miR-1246 表達對 LPS 誘導的 hPDLCs 凋亡的影響 與LPS+anti-miR-NC 組比較，LPS+antimiR-1246 組細胞凋亡率降低，Bcl-2 表達水平升高，Bax表達水平降低（P<0.05，圖2、表5）。

表5 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 凋亡的影響（，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS（，n=9）

表5 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 凋亡的影響（，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS（，n=9）

Note：Compared with LPS+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Bax protein 0.75±0.05 0.42±0.041）15.461 0.000 Groups LPS+anti-miR-NC LPS+anti-miR-1246 t P Apoptosis rate（%）28.15±2.57 11.89±1.051）17.571 0.000 Bcl-2 protein 0.11±0.02 0.51±0.041）26.833 0.000

圖2 抑制miR-1246 表達對LPS 誘導的hPDLCs 凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS

2.6 miR-1246 過表達逆轉了哈巴苷（80 μmol/L）對LPS 誘導的hPDLCs 損傷的作用 與LPS+HG+miR-NC 組比較，LPS+HG+miR-1246 組 miR-1246 及TNF-α、IL-1β 水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2 表達水平降低，Bax表達水平升高（P<0.05，圖3、表6）。

表6 miR-1246過表達逆轉了哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs損傷的作用（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced hPDLCs damage（，n=9）

表6 miR-1246過表達逆轉了哈巴苷對LPS誘導的hPDLCs損傷的作用（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced hPDLCs damage（，n=9）

Note：Compared with LPS+HG+miR-NC group，1）P<0.05.

Bax protein 0.32±0.02 0.64±0.041）21.466 0.000 Groups LPS+HG+miR-NC LPS+HG+miR-1246 t P miR-1246 1.00±0.06 2.38±0.211）18.956 0.000 TNF-α（ng/ml）4.66±0.36 8.24±0.561）16.133 0.000 IL-1β（ng/ml）3.19±0.22 9.71±0.511）35.216 0.000 Apoptosis rate（%）8.91±0.85 21.23±1.921）17.602 0.000 Bcl-2 protein 0.55±0.04 0.21±0.021）22.808 0.000

圖3 miR-1246 過表達逆轉了哈巴苷對LPS 誘導的hP?DLCs凋亡的作用Fig.3 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs

3 討論

牙周病是一種牙周組織破壞的炎癥性疾病，而LPS 可引發牙周組織損傷，誘發炎癥因子的釋放從而導致牙周炎的發生［8-9］。因此，本實驗用LPS 處理hPDLCs，結果顯示，LPS 誘導的 hPDLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax 表達水平升高；TNF-α、IL-1β 是促炎細胞因子，牙周炎中TNF-α、IL-1β 高表達［10］；表明LPS 可促進hPDLCs 中炎癥因子的釋放和細胞凋亡，誘導了hPDLCs 損傷。研究報道哈巴苷通過降低神經細胞凋亡，對急性腦缺血有保護作用［11］。哈巴苷可通過減少內質網應激來保護大鼠皮質神經元免受氧葡萄糖剝奪和復氧誘導的損傷［12］。為研究哈巴苷是否對hPDLCs 損傷有保護作用，本實驗采用不同濃度的哈巴苷處理LPS 誘導的hPDLCs，結果顯示，hP?DLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，且呈濃度依賴性；表明哈巴苷劑量依賴的抑制LPS誘導hPDLCs凋亡和炎癥因子的釋放，對LPS誘導的hPDLCs損傷具有保護作用，提示哈巴苷有發展成為新型牙周病治療藥物的潛能。

研究報道miR-1246通過調節PKA和PP2A誘導間充質干/基質細胞的促炎反應［13］。lncRNA CAIF通過下調miR-1246 抑制LPS 誘導的骨關節炎CHON-001 細胞中 IL-6 上調［14］。lncRNA NEAT1 通過靶向miR-1246 誘導由NF-κB 介導的炎癥因子的分泌，從而促進角膜新生血管形成進程［15］。以上研究表明miR-1246 參與調控細胞炎癥因子的釋放。本實驗結果顯示LPS 誘導的hPDLCs 中miR-1246 表達水平升高，抑制 miR-1246 表達后，LPS 誘導的 hPDLCs 中TNF-α、IL-1β 水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2 表達水平升高，Bax 表達水平降低，表明抑制miR-1246表達可抑制LPS 誘導的hPDLCs 凋亡和炎癥因子的釋放。此外，本實驗還發現哈巴苷處理后的hPDLCs中miR-1246 表達水平降低；而miR-1246 過表達逆轉了哈巴苷對LPS 誘導的hPDLCs 損傷的作用。提示，哈巴苷可調控的miR-1246表達。

綜上所述，哈巴苷可通過抑制miR-1246 表達抑制LPS誘導的hPDLCs凋亡和炎癥因子的釋放，從而保護hPDLCs免受LPS誘導的損傷。