外源添加肉桂醛提高煙草幼苗抵御鹽脅迫機理的研究

劉曉涵，李雪利，王悅霖，宋佳倩，徐亮，葉協鋒，吳東，王靜*

1 河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002；

2 廣東省韶關煙葉復烤有限公司，韶關 512000；

3 中國煙草總公司職工進修學院，鄭州 450002；

4 湖北中煙工業有限責任公司，武漢 430000

鹽脅迫是威脅全球作物產量和品質的環境因素之一。農業生產中過量的化肥施用以及使用低質量的灌溉水，愈發加劇了土壤鹽漬化的進程。目前，全球超過20%的耕地受到鹽漬化的危害，而這個數字還在逐年增長[1]。在鹽脅迫中Na+起關鍵的脅迫作用，過多的Na+會阻礙植物對營養離子的吸收，最終導致植物體內離子失衡[2]。此外Na+大量進入植物細胞內，一方面導致植物體內Na+/K+比值升高，會置換質膜的鈣，另一方面會破壞質膜上的膜保護系統，致使膜脂過氧化作用加劇，離子外滲造成礦質營養的缺失[3]。同時在煙草種植過程中，硫酸鉀作為追施鉀肥的主要來源，在煙草生產中廣泛使用，其用量在75～360 kg/hm2[4-5]；煙草吸收K+后，大量的SO42-被殘留在土壤中，成為煙田鹽漬化的隱患。近年來調查發現，植煙土壤已經出現次生鹽漬化現象[6-8]，2017年對洛陽典型煙區的土壤狀況調查發現，SO42-含量普遍高于0.35 g/kg，并且隨著硫酸鉀使用的增多以及植物吸收量的限制導致土壤中SO42-逐年富集[9]。對番茄[10]、小麥[11]、沙棗[12]等作物的研究表明，高濃度SO42-具有明顯的毒性，影響作物的產量和品質。但煙草在這方面的研究還較少，因此，研究過量硫酸鈉對煙草造成的危害并尋找可能的緩解途徑是十分必要的。

通過外源添加緩解物質調控植物的耐鹽性是保證鹽漬化土壤安全、高效生產的重要措施。研究表明，一些植物生長調節劑能通過增加滲透壓以及提高抗氧化酶的活性，提高植物對非生物脅迫的抗性[13-14]。肉桂醛作為一種添加劑廣泛應用在醫藥和工業研究中，其具有較強的殺菌消毒功能，常用保鮮防腐防霉劑。它能夠調節活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的含量且能提高部分抗氧化酶的活性來消除ROS，從而達到消炎目的[15-16]；WU等[17]用肉桂醛熏蒸處理柑橘，發現肉桂醛熏蒸處理能夠顯著提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，繼而降低果實酸敗腐病的發生率。WANG等[18]發現肉桂醛能夠提高獼猴桃的抗氧化能力并延緩其衰老。

本研究選擇硫酸鈉為鹽脅迫處理，肉桂醛為緩解劑，煙草品種K326作為研究對象，通過測量煙草幼苗根長、化學染色和qRT-PCR等方法，探究肉桂醛提高煙草幼苗耐鹽脅迫的機理，以期為提高植物耐鹽性研究以及鹽漬化土壤改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種：K326（由玉溪中煙種子有限公司提供）。

1.2 試驗方法

用0.2%的高錳酸鉀將煙草種子消毒，消毒后用無菌水沖洗5～7次，將其種在MS培養基中，然后將培養皿置于光照培養箱中（光輻射200 μmol/m2/s，光照周期12 h/12 h（光/暗），相對濕度75%，溫度22℃）正常培養5 d，5 d后挑選長勢一致的幼苗（根長約5～6 cm）轉移到添加0～250 mmol/L硫酸鈉處理的培養基中，繼續培養5 d。通過測量煙草幼苗根系長度，確定能夠引起根伸長下降50%的硫酸鈉濃度（定義為EC50濃度）。采用Na2SO4脅迫的EC50濃度，選擇0～30 μmmol/L的肉桂醛進行處理，通過對根長的測定篩選出能夠有效緩解Na2SO4脅迫的最佳肉桂醛濃度。后續試驗將采用以下4個處理：CK（正常培養）、T1（75 mmol/L硫酸鈉處理）、T2（20 μmmol/L肉桂醛處理）、T3（75 mmol/L硫酸鈉和20 μmmol/L肉桂醛處理）。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 幼苗根長測定

在加入處理5 d后測量根長，每個處理測量30株幼苗根長。

1.3.2 幼苗鮮質量測定

各處理分別收集處理5 d后的幼苗100株，用濾紙吸干幼苗表面水分，稱重（以100株為單位），每個處理重復3次。

1.3.3 DAB和NBT染色

按照Frahry和Schopfer[19]的方法，用氮藍四唑（NBT）對根尖染色以檢測內源O2·-，用超景深顯微鏡觀察并拍照。

葉片內源H2O2可采用Nguyen等[20]的方法，用二甲基聯苯胺（DAB）進行染色，用超景深顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 煙苗生理指標測定

收集處理5 d后的幼苗整株，用液氮冷凍保存，用于生理指標測定，每個處理重復取樣3次。H2O2、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，過氧化物酶（Peroxidase，POD）、SOD和過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性使用試劑盒（蘇州科銘生物技術公司）測定。

SOD活性單位定義U：黃嘌呤氧化藕聯反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位（U/mL）；POD活性單位定義U：每克組織在每毫升反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活單位；CAT活性單位定義：每克組織每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

1.3.5 SOD和GSH基因轉錄分析

各處理分別收集處理5 d后的幼苗1 g，迅速液氮凍存研磨，立即采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time qRT-PCR）兩步法測定轉錄水平，每個處理重復3次。RNA的提取采用成都福際生物公司試劑盒說明書的方法進行（Plant Total RNA Isolation Kit），RNA提取后用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀檢測其濃度和純度，并立即進行反轉錄。cDNA的反轉錄使用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒進行，具體操作步驟詳見反轉錄試劑盒使用說明書。合成的cDNA于-80℃條件下保存備用。根據煙草基因組數據庫的核苷酸序列設計特異性引物（表1），qRT-PCR采用LightCycler? 480II 實時熒光定量PCR儀，反應條件為：94℃ 2 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃ 2 min。煙草的管家基因Actin作為計算時的內參基因，相對表達量計算采用2-ΔΔCt方法計算。

表1 RT-PCR引物序列Tab. 1 Primers for qRT-PCR

1.4 數據處理

所有數據采用Microsoft Excel 2017和SPSS 22.0軟件進行數據處理和差異顯著性檢驗（α=0.05）。

2 試驗結果與分析

2.1 篩選適宜的硫酸鈉脅迫濃度和肉桂醛緩解濃度

由圖1A可知，煙草幼苗對于Na2SO4十分敏感，處理3 d和處理5 d，加入Na2SO4處理的煙草幼苗較未加Na2SO4處理的煙草幼苗根系增長量和幼苗鮮重降低，H2O2含量增加。在正常培養基中處理5 d，煙苗根長平均增長7.4 mm，加入100 mmol/L的Na2SO4后煙苗根長增長量相較未加Na2SO4平均降低5.6 mm，鹽濃度越高，煙苗根長越短。煙苗鮮重的變化趨勢與根長增長量一致，表現為Na2SO4濃度越高，煙苗生長受抑制效果越嚴重。對各處理H2O2含量分析可知（圖1B），在處理5 d后，未加鹽處理的H2O2含量最低，為0.65 μmol/g；當Na2SO4濃度達到250 mmol/L時，H2O2的積累量為未加鹽處理的214.67%。數據計算使煙苗根伸長降低至對照一半時的Na2SO4濃度為75 mmol/L，因此選擇該濃度作為鹽處理濃度進行后續試驗。

圖1 硫酸鈉和肉桂醛處理對煙苗的影響Fig.1 Effects of sodium sulfate and cinnamaldehyde on tobacco plant

加入肉桂醛后，煙苗的根長增長量和鮮重都較未加肉桂醛處理有增加，其中在肉桂醛濃度為20 μmol/L時，效果最明顯，根長增長量較未加肉桂醛處理增長79.6%，幼苗鮮重增長46.0%。這些結果表明，使用肉桂醛能夠緩解鹽脅迫對煙草幼苗生長的抑制作用，促進煙草幼苗的生長，其最適濃度為20 μmol/L。

2.2 肉桂醛對硫酸鈉脅迫下煙草幼苗的緩解作用

2.2.1 對煙草幼苗生長量的影響

由圖2A可知，CK和T2處理，煙草幼苗的根長無明顯差別，T1處理煙苗根長明顯縮短，加入肉桂醛以后（T3處理），根長有所增長。煙苗根長5 d后，CK的煙苗根長增長量為8.11 mm，單獨使用肉桂醛對根長影響不大，其根長增長量為8.09 mm；T1處理煙草幼苗的根長增長幅度明顯降低，僅為2.20 mm；而T3處理明顯促進根長增長，較T1處理增長92.45%（圖2B）。

煙苗鮮重表現出與根長相同的變化趨勢，單獨使用肉桂醛煙苗的鮮重為0.49 g，相較CK僅降低了0.02 g，總體比較無明顯差異；在鹽脅迫下煙苗生長受到明顯抑制，煙苗鮮重為0.28 g，在鹽與肉桂醛混合處理中，煙苗鮮重較鹽處理有所增加，為0.36 g（圖2C）。

圖2 硫酸鈉和肉桂醛處理對對煙苗生長的影響Fig.2 Effects of sodium sulfate and cinnamaldehyde on tobacco growth

2.2.2 對H2O2和MDA含量的影響

鹽分和肉桂醛對煙草幼苗H2O2和MDA含量有顯著影響。鹽脅迫引起煙草幼苗活性氧過量產生，導致脂質過氧化和細胞膜損傷。組織化學染色可以清楚顯示煙苗體內O2·-和H2O2的分布，分別為帶有深藍色斑點和棕色斑點，從圖3A和圖3B可以看出，CK處理的O2·-和H2O2的含量均較少，葉片中無明顯褐色，根部無明顯藍色；T1處理葉片分布較多褐色斑塊，尤其是幼芽部分顏色較重，根尖能看到明顯藍色，表明鹽能促進幼苗體內ROS的產生；T2處理中，O2·-的產生較少，但從根尖染色可以看出，在根表面有藍色附著，表明肉桂醛會調節H2O2的產生；在T3處理中，褐色區域只分布在嫩芽，在根尖部分區域呈藍色斑點，其余部分藍色相對鹽處理明顯減少。

數據與染色圖片表現一致，從圖3C和3D可知，CK處理H2O2和MDA含量都處于較低水平；在75 mmol/L Na2SO4處理下，H2O2和MDA含量均大幅度升高，分別為1.07 nmol/g和28.62 nmol/g，較CK增長了160.0 %和137.1%。單獨添加肉桂醛可以增加H2O2和MDA含量，但與CK相比無明顯差異。而在鹽脅迫下添加肉桂醛較單獨鹽處理降低了幼苗H2O2和MDA含量，其含量分別為0.74 nmol/g和21.51 nmol/g。結果表明，在鹽脅迫下，添加肉桂醛能顯著減少鹽脅迫誘導的H2O2和MDA。

圖3 處理5d后煙草幼苗體內活性氧積累狀況Fig.3 Reactive oxygen species accumulation in tobacco seedlings after treatment for 5 days

2.2.3 對抗氧化酶活性的影響

對煙草幼苗的SOD、CAT和POD活性進行比較表明，4個處理中，T1處理的SOD和POD活性最高，分別為172.28 U/g·FW 和10627 U/ g·FW，CAT酶活在T3處理中最高，為467.3 U/g·FW；CK中三種酶的活性均最低；而鹽脅迫和肉桂醛處理后，SOD活性較CK處理增加，但相比鹽處理有明顯降低趨勢，POD酶活與CK相比無顯著差異，鹽脅迫和肉桂醛的相互作用促進了CAT酶活的增強。通過三種抗氧化酶活性的變化可以看出，鹽脅迫條件下添加肉桂醛可以提高CAT酶活，但在一定程度上會降低POD和SOD酶活。

2.2.4 對抗氧化相關基因表達量的影響

為了進一步研究肉桂醛對與鹽脅迫下煙草幼苗在轉錄水平上的作用，我們對非酶抗氧化系統和酶抗氧化系統中的兩個關鍵基因SOD和GSH（還原性谷胱甘肽，Glutathione）表達量進行研究。從表5可以看出，鹽處理幼苗的SOD和GSH的表達水平都較高，分別是CK的3.4倍和2.0倍；在T3處理中SOD的表達量明顯降低，接近CK的水平，而GSH的表達量在四個處理中最高。這表明，受到鹽脅迫之后，煙苗體內抗氧化基因快速表達，而肉桂醛的使用可以降低SOD的相對表達量，誘導GSH的高表達。

圖4 處理5 d后煙草幼苗體內抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activity in tobacco seedlings after treatment for 5 days

圖5 處理5d后煙草幼苗SOD和GSH基因的表達量Fig.5 Expression levels of SOD and GSH genes in tobacco seedlings after treatment for 5 days

3 討論

土壤鹽堿化是農業生產中的一個嚴重問題，制約了可持續農業的發展[21]。近幾年研究發現，湖南和河南部分植煙土壤已經出現次生鹽漬化現象[7-9]，馬靜等[22]通過對烤煙葉肉細胞亞細胞結構分析發現，當Na2SO4濃度為200 mmol/L時，葉綠體結構膨脹、線粒體內膜溶解、細胞核萎縮、核仁解體。本研究發現隨著Na2SO4濃度的升高，煙苗根長增長速率減緩，生物積累量降低，并且誘導H2O2的大量產生。當添加20 μmol/L的肉桂醛后，煙草幼苗可以部分恢復在鹽脅迫下的生長能力，根長增長速率較鹽處理增加，生物積累量也有所增加，這表明肉桂醛對緩解鹽脅迫有一定的效果。

鹽脅迫會誘導ROS的積累，這是氧化應激的必然產物，過量的ROS會對細胞產生毒害作用[23]。本研究結果表明，與對照相比，Na2SO4脅迫的幼苗體內MDA和H2O2的積累顯著增加；Na2SO4與肉桂醛同時處理后H2O2和MDA含量明顯降低，這與錢霄晨等[24]的研究結果一致，可能是肉桂醛降低了鹽誘導的H2O2積累和脂質過氧化所造成的潛在影響。孫琦和王帆等[15-16]研究表明肉桂醛作為一種外源添加劑能夠調節ROS的含量且能提高部分抗氧化酶的活性來消除ROS；也有研究指出肉桂醛可能通過加成反應導致Ca2+外排進而影響ROS的產生[25]；后有研究證明，肉桂醛能夠通過抑制丙二醛（MDA）含量上升，促進脯氨酸的積累量，從而延緩香菇的衰老[26]。

為了保護自身免受氧化應激，植物進化出了酶和非酶活性氧清除系統，這些系統在保護膜系統的結構和功能以及維持細胞氧化還原狀態方面起著至關重要的作用[27]。在植物中，超氧化物歧化酶（SOD）是將O2·-轉入H2O2和O2的第一道防線，隨后H2O2通過CAT、POD、抗壞血酸—谷胱甘肽循環等作用轉化為水而消除[28]。本試驗的研究結果表明，鹽處理能顯著提高煙草幼苗SOD、POD和CAT的活性，而使用肉桂醛后增強了CAT活性，這表明肉桂醛誘導的鹽脅迫下H2O2的含量的降低導致SOD和POD并不需要非常活躍就能夠達到清除活性氧的目的，這與Mishra等[29]的結果相似，而較高的CAT活性對于清除H2O2有著起到延緩效果，能夠保證在O2·-轉入H2O2后將其有效清除。同時GSH清除H2O2的能力強，在煙草抗病和逆境脅迫研究過程中起著重要的作用[30-31]。本研究中鹽處理幼苗的SOD和GSH快速表達，添加肉桂醛后誘導GSH的高表達，推測該基因的大量表達可以提高植株的抗氧化能力從而提高煙草幼苗對鹽脅迫的耐受能力。WU[17]和WANG[18]等發現肉桂醛能夠顯著提高植物的抗氧化能力，這些結果證實了肉桂醛對于脅迫條件下植物的抗氧化系統存在調控作用。

4 結論

隨著硫酸鈉濃度的升高，煙苗受到的抑制作用越明顯，根系生長減緩，植株鮮重降低，H2O2積累增加，而肉桂醛的使用可以有效緩解這種脅迫作用。在75 mmol/L Na2SO4處理中加入20 μmol/L的肉桂醛可以促進煙草幼苗根系的生長，更好的促進營養積累；同時可以有效降低MDA和H2O2的積累，減緩氧化應激給煙苗造成的傷害，從而降低SOD和POD的酶活；并誘導CAT酶活的提高來增強煙苗的抗鹽能力。