煙草NtMHX1和NtMHX2基因的克隆及不同金屬離子脅迫下的表達模式分析

張吉順，張孝廉，楊慧，賈蒙驁，張婕，趙德剛

1 貴州大學生命科學學院/農業生物工程研究院，貴州省農業生物工程重點實驗室，山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；

2 貴州省煙草科學研究院，煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴陽 550081；

3 貴州省農業科學院農業部DUS中心貴陽分中心，貴陽 550006

鎂是植物生長發育所必需的金屬元素，參與植物體的多個生理代謝過程。煙草（Nicotiana tabacum）是以收獲葉片為主的經濟作物，鎂元素不僅影響烤煙的農藝性狀，還與烤煙品質有著密切的關系[1]。烤煙在缺鎂和高鎂條件下，葉片葉綠素含量均會顯著降低[2]。很多研究都證明了，施鎂可以有效地提升煙葉的產質量并較好地協調煙葉中的化學成分，提升煙葉吸食品質[1,3-5]。

植物中鎂的吸收、運輸和分配受到不同基因家族的調控，目前已發現有4個家族蛋白參與了鎂離子的運輸[6-9]，包括：CroA亞家族的部分成員、SV（slow-vacuolar）通道蛋白、環核苷酸相聯的離子通道AtCNGC10、MHX蛋白。其中MHX蛋白屬于CaCA（Ca2+/Cation Antiporter）亞家族，對植物鎂離子平衡具有重要作用。擬南芥AtMHX主要負責質子和Mg2+、Zn2+和Cd2+的交換[10-11]，AtMHX蛋白將金屬離子扣留在液泡中，并將液泡中的質子釋放到細胞質中。在橡膠樹中也發現MHX具有交換質子和Mg2+、Zn2+、Cd2+離子的功能[12-13]。

Gaash等[14]對擬南芥（Arabidopsis thaliana）、馬 鈴 薯（Solanum tuberosum）、番 茄（Solanum lycopersicum）、葡萄（Vitis vinifera）、大豆（Glycine max）、 水 稻（Oryza sativa）、 小 麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）和小立碗蘚（Physcomitrella patens）等植物中MHX蛋白進行進化和結構模型分析，發現MHX蛋白是植物所特有，且大部分植物都只有一個MHX同源基因。目前，煙草中MHX蛋白的序列信息和功能尚不明確，本文對栽培煙草中的MHX基因進行克隆，對其編碼蛋白進行了生物信息學分析，并檢測了不同金屬離子處理下該基因的表達模式變化，為MHX基因在煙草中的作用及分子機制研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料為栽培煙草（Nicotiana tabacum L.）K326。采用漂浮育苗法育苗，溫室培養至5～6片真葉時將幼苗移栽至含有基質的花盆中培養，分別取幼苗期的根、莖、葉和開花期花，液氮迅速冷凍，于-80℃保存備用。將5～6片真葉期的煙苗移栽至1/4濃度的Hogland營養液中培養14 d，每7 d更換一次新的營養液，分別在1/4濃度的Hogland營養液中添加100 mmol/L的NaCl、100 mmol/L的KCl、100 mmol/L的CaCl2、50 mmol/L的ZnSO4，50 mmol/L的MnCl2，50 mmol/L的MgSO4、50 mmol/L的CuSO4和50 μmol/L的CdCl2進行不同金屬離子的脅迫處理，并于添加金屬離子的0 d、1 d、2 d、4 d和6 d取煙草葉片，以不額外添加金屬離子的1/4濃度的Hogland營養液中培養的煙苗做為平行對照，同步取樣，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存備用，每個處理設置3次重復。

1.2 NtMHX基因的克隆及測序

以擬南芥MHX基因全長CDS序列（登錄號：AT2G47600）為信息探針，利用NCBI煙草數據庫比對，獲得煙草MHX基因同源序列，選擇一致性最高的序列，利用Primer Primer 5.0設計CDS全長克隆引物MHX-F和MHX-R（表1），分別以煙草‘K326’的cDNA為模板，使用NEB公司的KOD Fx NEO高保真酶進行煙草MHX基因的CDS序列的PCR擴增。利用天根膠回收試劑盒對PCR產物進行膠回收后，連入pGEM-T載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆送去上海生工公司測序。

1.3 生物信息學分析

在NCBI網 站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上BLASTp進行蛋白預測，利用Specialized BLAST （CDD search）進行保守域分析。選擇其他物種中相似性較高的MHX序列16條用MEGA5.0構建系統進化樹，采用鄰接法（Neighor Joining Method）作圖，重復次數為1000。在蛋白生物信息學網站（http://www.expasy.org/）對NtMHX蛋白進行理化性質、親水性/疏水性、跨膜結構、二級結構及三級結構進行預測和分析。

1.4 NtMHX基因的表達分析

根據NtMHX1和NtMHX2的CDS序列設計熒光定量特異引物2對（表1），同時選用煙草Actin基因（NTU60495）為內參基因，并設計定量PCR引物Ref-RT-F和Ref-RT-R （表1）。采用SYBR Green法在ABI Vii7實時熒光定量PCR儀上進行Real Time-PCR實驗，設置3次生物學重復和3次實驗重復，PCR反應體系和反應程序參照TaKaRa定量PCR試劑盒說明書。對溶解曲線、擴增效率和相關系數進行分析，選取特異性好、擴增效率接近1的引物進行實驗，分析NtMHX1和NtMHX2基因在煙草組織及不同金屬離子處理后各時間點的表達情況。將根中和金屬離子處理0 d的葉片的相對表達量分別設置為1，其余組織中相對表達量按照2-??CT法進行計算。

表1 本文中使用引物的序列信息Tab. 1 Sequence information of primers used in this research

2 結果分析

2.1 NtMHX基因克隆

以栽培煙草K326葉片總cDNA為模板，MHX-F和MHX-R為引物，擴增獲得1800 bp左右的片段（圖1）。經測序分析，共獲得2個NtMHX基因CDS序列，一條1623 bp，命名為NtMHX1；一條1641 bp，命名為NtMHX2，序列一致性為96.4%，并擴增到了NtMHX2的一個選擇性剪切體，長度為1620 bp，缺失了21 bp（844-864 bp）。選擇NtMHX1和1641 bp的NtMHX2序列編碼的蛋白進行后續的生物信息學分析和進化分析。

圖1 煙草葉片RNA和NtMHX基因PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of RNA and NtMHXgenes in tobacco leaves

2.2 NtMHX蛋白的生物信息學分析

2.2.1 NtMHX蛋白質理化性質及親/疏水性

利用在線軟件ExPASy-ProtParam對NtMHX1蛋白物理化學性質進行分析，結果顯示，該蛋白質分子式為C2822H4291N689O758S12，由540個氨基酸組成，相對分子量為60382.99 Da，理論等電量（pI）為5.66，屬于酸性蛋白質，由20種氨基酸組成，其中Leu含量最多，占總數的11.7%，而Met的含量最少，占總數的0.7%；該蛋白為穩定蛋白，不穩定系數為38.07（＜40），脂肪族氨基酸指數為111.59，總親水性平均值為0.408。

NtMHX2蛋白物理化學性質分析結果顯示，該蛋白質分子式為C2850H4333N693O766S13，由546個氨基酸組成，相對分子量為60977.72 Da，理論等電量（pI）為5.63，為酸性蛋白質。由20種氨基酸組成，其中Leu含量最多，占總數的11.2%，而Met的含量最少，占總數的0.9%。該蛋白為穩定蛋白，不穩定系數為33.16（＜40），脂肪族氨基酸指數為111.25，總親水性平均值為0.414。

利用在線軟件ProtScale進一步對蛋白質的親水疏水性進行分析，結果顯示，組成NtMHX1蛋白的氨基酸大部分是疏水性氨基酸，其中，第527位分值最高，為3.222，第235位分值最低，為-2.633，說明該蛋白為疏水性蛋白。組成NtMHX2蛋白的氨基酸大部分是疏水性氨基酸，其中，第533位分值最高，為3.222，第235位分值最低，為-2.367，說明該蛋白為疏水性蛋白。

2.2.2 分析NtMHX蛋白跨膜域及亞細胞定位

利用在線軟件TMHMM 2.0分析預測NtMHX蛋白跨膜區域，結果（圖2）顯示，NtMHX1和NtMHX2蛋白均有11個跨膜區域，是跨膜蛋白。

圖2 NtMHX1和NtMHX2蛋白的跨膜結構域預測分析Fig.2 Prediction of the transmembrane domains of NtMHX1 and NtMHX2 proteins

利用在線軟件SignalP 4.0分析NtMHX信號肽分布，結果顯示，NtMHX1和NtMHX2蛋白均沒有信號肽，為非分泌蛋白。

使用Plant-mPLoc軟件預測NtMHX蛋白的亞細胞定位，推測NtMHX1和NtMHX2蛋白定位于細胞膜上。

2.2.3 分析NtMHX蛋白磷酸化位點

通過在線軟件NetPhos 3.1預測NtMHX蛋白氨基酸上的磷酸化位點（圖3）發現，NtMHX1蛋白氨基酸上共有45個磷酸化位點，其中包括26個Ser磷酸位點、12個Thr磷酸位點和7個Tyr磷酸位點。NtMHX2蛋白氨基酸上共有40個磷酸化位點，其中包括22個Ser磷酸位點、10個Thr磷酸位點和8個Tyr磷酸位點。

圖3 NtMHX1和NtMHX2蛋白的磷酸化位點預測Fig.3 Prediction of phosphorylation sites in NtMHX1 and NtMHX2 protein sequences

利用在線軟件NCBI-CD Search對NtMHX蛋白保守結構域進行預測（圖4），NtMHX1和NtMHX2均存在兩個CACa蛋白家族的保守結構域。

圖4 煙草MHX蛋白保守結構域預測Fig.4 Prediction of conserved domains of MHX proteins

2.2.4 分析MHX蛋白高級結構

通過在線軟件SOPMA對NtMHX蛋白二級結構進行預測，結果（圖5）顯示，NtMHX1蛋白的α螺旋占45.37%，延伸鏈占15.19%，β轉角占5.74%，無規則卷曲占33.70%。NtMHX2蛋白的α螺旋占44.14%，延伸鏈占16.48%，β轉角占5.13%，無規則卷曲占34.25%。使用SWISS-MODEL在線軟件對NtMHX蛋白的三級結構進行預測，結果如圖6，與二級結構預測結果一致，這兩個蛋白富含α螺旋和無規則卷曲。

圖5 NtMHX1和NtMHX2蛋白二級結構預測Fig.5 Prediction for secondary structure of NtMHX1 and NtMHX2 proteins

圖6 NtMHX1和NtMHX2蛋白三級結構預測Fig.6 Prediction for thridary structure of NtMHX1 and NtMHX2 proteins

2.3 NtMHX蛋白序列比對及進化分析

在NCBI數據庫中使用Protein Blast程序對NtMHX1和NtMHX2蛋白進行保守區域檢索，發現該蛋白包含2個CaCA結構域，屬于CaCA亞家族。經過蛋白同源檢索，發現來自不同植物物種的MHX蛋白有很高的相似性。NtMHX1與煙草野生種絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）的一致性為99.81%，與林煙草（Nicotiana sylvestris）的一致性為96.67%，NtMHX2與林煙草的一致性為99.82%，與絨毛狀煙草的一致性為96.34%，推測NtMHX1來源于絨毛狀煙草，而NtMHX2來源于林煙草。

選擇部分序列相似性較高、功能注釋明確或有文獻報道的MHX蛋白序列，利用Clustral X進行序列比對（圖7），發現這兩個蛋白具有保守的11個跨膜結構域。煙草NtMHX1和NtMHX2蛋白與茄科植物番茄、馬鈴薯具有100%的序列覆蓋度，與野生番茄序列一致性最高，分別為92.78%和91.77%，與馬鈴薯MHX蛋白序列一致性分別為92.59%和91.77%。用MEGA5.0進行系統進化樹的繪制（圖8），結果可以看出，煙草和同屬茄科植物的馬鈴薯、番茄MHX序列處于同一分枝上。序列比對和聚類分析結果均表明煙草NtMHX1、NtMHX2蛋白與番茄和馬鈴薯的親緣關系最近。

圖7 不同植物MHX蛋白序列同源性比較Fig.7 Homology comparison of MHX proteins from different plants

圖8 NtMHX1和NtMHX2的系統進化分析Fig.8 Phylogenetic analysis of NtMHX1 and NtMHX2

選擇部分序列相似性較高、功能注釋明確或有文獻報道的MHX蛋白序列，利用Clustral X進行序列比對（圖7），發現這兩個蛋白具有保守的11個跨膜結構域。煙草NtMHX1和NtMHX2蛋白與茄科植物番茄、馬鈴薯具有100 %的序列覆蓋度，與野生番茄序列一致性最高，分別為92.78 %和91.77 %，與馬鈴薯MHX蛋白序列一致性分別為92.59 %和91.77 %。用MEGA5.0進行系統進化樹的繪制（圖8），結果可以看出，煙草和同屬茄科植物的馬鈴薯、番茄MHX序列處于同一分枝上。序列比對和聚類分析結果均表明煙草NtMHX1、NtMHX2蛋白與番茄和馬鈴薯的親緣關系最近。

2.4 NtMHX基因的組織表達特性

分別從未處理的煙草的根、莖、葉、花中提取RNA進行熒光定量分析得到結果顯示（圖9），NtMHX1和NtMHX2基因在根中表達量最低，在莖中表達量最高。

圖9 NtMHX1和NtMHX2基因的組織表達特性Fig.9 The relative expression level of NtMHX1 and NtMHX2 in different tissues of Nicotiana tabacum

2.5 金屬離子處理對NtMHX基因表達的影響

將苗期煙草經過不同離子處理后，檢測NtMHX1和NtMHX2基因在葉片中的相對表達量。結果（圖10）顯 示，50 mmol/L Mg2+處 理 后，NtMHX1和NtMHX2基因表達水平迅速升高并在1 d時達到最大值（分別為2.88和2.64）后逐漸下降，在6 d左右恢復至處理前水平。50 mmol/L Mn2+處理后，NtMHX1和NtMHX2基因轉錄水平呈現先升高后下降的趨勢，在處理后2天達到最大值（分別為3.80和3.90）。100 mmol/L Ca2+處理后，NtMHX1和NtMHX2基因的相對表達量迅速升高，在處理后2 d達到最大值（6.08和5.75）后逐漸減低。100 mmol/L K+處理后，NtMHX2基因轉錄水平先升高后降低，而NtMHX1基因表達水平呈現先升高后減低再升高的趨勢，兩個基因均再處理后2 d達到最大值，分別為5.66和6.34。100 mmol/L Na+處理后，NtMHX1和NtMHX2基因表達趨勢為先升高后減低，同樣在處理后2 d達到最大值（分別為6.84和6.02）。50 mM Zn2+處理后，NtMHX1和NtMHX2基因相對表達量先升高，在處理后2 d達到最大值（3.41和3.50）后減低。50 mmol/L Cu2+處理后，NtMHX1和NtMHX2基因轉錄本積累量先升高后減低，在處理后2 d達到最大值，分別為3.44和4.36。50 μmol/L Cd2+處 理 后，NtMHX1和NtMHX2基因轉錄水平迅速下降，處理后2 d的相對表達量為0.23和0.35，并在處理后4～6 d維持這一表達水平。

圖10 不同金屬離子對煙草葉片NtMHX1和NtMHX2表達水平的影響Fig.10 The effects of different metal ion treatments on the expression level of NtMHX1 and NtMHX2

3 討論

CaCA（Ca2+/cation antiporters）亞家族蛋白廣泛存在于不同的生物體內，從細菌到高等動植物都有該家族基因的報道。CaCA蛋白在維持植物體內離子平衡中發揮重要作用，進而影響了植物的生長發育[15]。根據蛋白結構和進化關系，CaCA亞家族可以分為CAX，CCX，NCL和MHX四個分支，其中MHX是植物中所特有的，且成員數量最少[14,16]。本文從煙草中克隆到2個MHX同源基因，命名為NtMHX1和NtMHX2，其中，NtMHX1來源于絨毛狀煙草，而NtMHX2來源于林煙草，并與茄科植物番茄和馬鈴薯的MHX蛋白位于同一分支上。

生物信息學分析發現，這兩個蛋白與其他植物中的MHX蛋白一樣，包含CaCA保守結構域，均有11個跨膜結構域，屬于跨膜蛋白，不含信號肽。亞細胞定位預測這兩個蛋白定位于細胞膜上，橡膠樹中該基因主要在液泡中表達[12-13]，鼠耳芥（Arabidopsis Halleri）中AhMHX基因定位在液泡膜上[17]。與細胞質相比，液泡中的環境偏酸性，AtMHX蛋白將金屬離子扣留在液泡中，并將液泡中的質子釋放到細胞質中，本研究也發現煙草中的NtMHX蛋白等電點為5.66和5.63，為酸性蛋白。

AtMHX基因在擬南芥的維管組織，尤其是韌皮部的相對表達量較高[18]，煙草NtMHX基因在根、莖、葉和花中都有表達，但莖中相對表達量最高，這與前人報道該基因主要在維管組織中表達的結果一致。鼠耳芥中AhMHX的基因表達量受植物體內Zn、Cd或者Mg含量狀態的影響不顯著[17]。本研究中不同金屬離子處理的表達模式分析顯示，Mn2+、Ca2+、K+、Na+、Zn2+處理后，NtMHX1和NtMHX2基因轉錄水平均先升高，后降低，并在處理2 d左右到達最大值，Cd2+處理后，NtMHX基因表達受到抑制，在2 d達到最低值。從不同金屬離子的響應時間及誘導水平來看，NtMHX基因對Mg2+的響應較早，Ca2+、K+、Na+離子處理對NtMHX基因的誘導水平要顯著高于Mg2+、Mn2+、Zn2+離子，只有Cd2+處理后，NtMHX基因的表達水平迅速下降，并維持低水平表達。分析發現Mn2+、Ca2+、K+、Na+、Zn2+是煙草生長發育所必需的營養元素，可以誘導NtMHX基因的表達，而有毒金屬元素鎘則可以抑制NtMHX基因的表達。推測NtMHX基因參與維持煙草體內金屬離子的平衡，其具體功能及機制有待進一步深入研究。

4 結論

（1）從栽培煙草中克隆到NtMHX1和NtMHX2基因，開放閱讀框全長分別是1623 bp和1641 bp，編碼540和546個氨基酸殘基，相對分子質量分別為60382.99 Da和60977.72 Da，均是包含11個跨膜結構域的酸性蛋白。

（2）進化分析表明，NtMHX1和NtMHX2與野生番茄和馬鈴薯的MHX蛋白高度相似。

（3）表達分析表明，NtMHX1和NtMHX2基因在煙草根、莖、葉、花中均有表達，且在莖中的表達水平最高。NtMHX基因的表達受到Mg2+、Mn2+、Ca2+、K+、Na+、Zn2+和Cu2+的誘導，并受到Cd2+的抑制，推測NtMHX基因在維持煙草體內金屬離子的平衡中發揮重要作用。