速生型普通產酮基古龍酸菌的高通量篩選方法

盧曉明，李曉東

（石藥集團 維生藥業（石家莊） 有限公司，河北 石家莊 050035）

0 引 言

國內維生素C 的生產采用兩步發酵的生產工藝，第1 步是單菌發酵，將D- 山梨醇轉化成L-山梨糖；第2 步是混合菌發酵，通過普通產酮基古龍酸菌（Ketogulonicigenium vulgare） （俗稱小菌）及其伴生菌巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）（俗稱大菌） 的共同作用將L- 山梨糖轉化成2- 酮基- L- 古龍酸（2- KGA），其中小菌為產酸菌，其代謝產酸能力決定發酵強度。因此，選育生長快、產酸速率高的速生型小菌是提高生產效率的關鍵。

普通產酮基古龍酸菌的生長代謝受多種脫氫酶的影響，由于菌株誘變后菌體形態和菌落特征發生改變的幾率很小，挑選沒有目的性。為了避免漏篩，對誘變后存活單菌落基本上是全部檢測，由于菌落直徑不足1 mm，常規的篩選方法需將單菌落富集培養后，再通過試管或搖瓶培養，根據每個菌株的生長產酸情況判定取舍，篩選量大，且周期很長。

瓊脂平板篩選法和微孔板篩選方法是目前常用的2 種篩選方法。

劉志鈺等人通過抑菌圈和微孔板法篩選出高產菌。

劉堂浩等人利用熒光強度變化高通量篩選產酪氨酸釀酒酵母。

目前，尚無普通產酮基古龍酸菌基于酶學特性及產物特點等方面的高通量篩選方法的報道。由于普通產酮基古龍酸菌為好氧菌，生長較慢，對雜菌的抵御能力弱，篩選過程需振蕩培養，并保證無菌度，不適于用微孔板或深孔板培養等裝置進行篩選。

基于上述原因，為了防止漏篩、提高篩選效率和準確性，本研究對檢測手段和培養裝置進行更新，通過在固體平板和液體培養基中添加適量混合指示劑，使反應體系在pH=6.0～7.0 顏色變化靈敏；同時，采用可滅菌的2 mL 圓底離心管作為培養裝置，裝液量少，可直接培養小菌單菌落，無需先經過擴大培養再檢測。

建立了基于培養基顏色鑒別與離心管組合培養相結合的適用于普通產酮基古龍酸菌的高通量篩選方法，縮短了檢測周期，并大幅提高了單次檢測數量。通過此方法，選育得到了一株生長快產酸高的速生型菌株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株普通產酮基古龍酸菌，編號為843，由維生藥業（石家莊） 有限公司提供。

1.1.2 試 劑

（1） 溴甲酚紫。

（2） 溴百里酚藍。

（3） 甲基紅。

以上試劑均購自于天津科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 儀 器

（1） 生物顯微鏡：XSP- 9CP，上海光密儀器。

（2） 恒溫培養搖床：QYC- 2112，上海福瑪。

（3） 恒溫培養箱：DPX- 9082B，上海福瑪。

（4） 潔凈工作臺：SW- CJ- 1CU，蘇凈安泰。

（5） 全自動發酵罐：BLBIO- 50SQA，上海百侖。

1.1.4 培養基

（1） 鑒別固體培養基（g/L）：山梨糖15、酵母膏3、玉米漿3、蛋白胨8、尿素1、MgSO4·7H2O 0.1、KH2PO41、CaCO31、溴甲酚紫、溴百里酚藍、甲基紅混合指示劑0.05、瓊脂15，pH=7.0～7.5。

（2） 鑒別種液培養基（g/L）：山梨糖15、酵母膏3、玉米漿3、蛋白胨10、尿素1、MgSO4·7H2O 0.1、KH2PO41、溴甲酚紫、溴百里酚藍、甲基紅混合指示劑0.02，pH=6.8～7.2。

（3） 發酵培養基(g/L)：山梨糖80、酵母膏1、玉米漿12、尿素10、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.1、CaCO35，pH=6.8～7.2。

1.2 方 法

1.2.1 誘變菌株的固體平板鑒別

（1） 稀釋分離：將經過誘變處理的小菌菌體懸液用無菌蒸餾水逐級稀釋至1/1000，吸取0.05～0.1 mL 稀釋液，均勻涂布于鑒別固體養基平板中，在30±2 ℃靜置培養。

（2） 鑒別培養：恒溫培養48 h，開始觀察單菌落生長和菌落周圍培養基顏色改變情況。

1.2.2 誘變菌株的菌液鑒別

（1） 培養裝置的設計制作

將數十支2 mL 圓底離心管置于1 個離心管盒中，組成1 個培養單元，每支離心管分裝0.5 mL鑒別種液培養基，在121±1 ℃滅菌15 min，備用。每批次根據待檢菌株的多少設置培養單元的數量。

（2） 種液鑒別培養

在潔凈工作臺上，用無菌勺挖取平板上誘變存活的單菌落，接入裝有無菌鑒別種液培養基的離心管中，立即關閉管蓋，每個菌落對應1 支離心管。從每個培養單元中取1 支管，同時接入1 個未經誘變的對照單菌落，作為陽性對照，1 支空白培養基作為對照。

在30±2 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養24 ～48 h，觀察菌液的顏色變化。

1.2.3 培養基顏色變化程度與產酸關系的判斷

（1） 固體平板：挑取變色程度及變色圈大小不同的小菌單菌落，分別接入裝有鑒別種液培養基的離心管中，并留一管培養基作為空白對照。

在30±2 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養40 ～48 h，觀察顏色變化。

（2） 種液培養基：挑取1 個大菌單菌落，溶于10 mL 無菌水中，振蕩形成菌懸液。分別吸取0.1 mL 大菌菌液，接入（1） 所述的離心管組中的變色程度不同的小菌菌液中，組成大小菌混合液。搖勻后，全部轉移至30 mL/250 mL 三角瓶種液培養基中。在30±2 ℃、200 r/min 條件下培養18 ～24 h，測定2- KGA 的生成量。

再吸取5 mL 種液，轉接入40 mL/500 mL 三角瓶的發酵培養基中，發酵培養24、48 h，取樣測定2- KGA 的生成量，考察離心管菌液的變色程度及變色時間與產酸的關系。

1.2.4 速生菌株的驗證

將通過上述方法得到的速生型菌株與對照菌株進行對比實驗。制備出2 個菌株的大菌與小菌的混合斜面，用接種環分別刮取一環菌苔，接入100 mL/500 mL 三角瓶種液的培養基中。在30±2 ℃、200 r/min 條件下培養17～20 h，即完成了種液的制備。

再吸取5 mL 種液，轉接入40 mL/500 mL 三角瓶發酵培養基中進行發酵對比，測定不同時期的產酸量。

2 結果與分析

2.1 固體平板鑒別結果

經過誘變的小菌懸液，在鑒別固體培養基中培養48 h，開始觀察單菌落生長狀態和菌落周圍培養基顏色改變情況。此后每隔8 h 觀察一次，單菌落周圍的培養基顏色開始變黃時進行標記，編號原則為首次發生變色時間- 菌落序號。

單菌落產酸初篩鑒別代表性結果如圖1 所示。

圖1 單菌落變色圈Fig. 1 Discolored circle of single colony

2.2 種液篩選結果

挑取固體平板上的誘變存活的單菌落，分別接入離心管組的鑒別種液的培養中，振蕩培養24～ 48 h。

觀察部分離心管中的菌液顏色陸續發生改變，從藍綠色變為淡綠色，繼續培養，顏色逐漸變為黃色，目測能分辨各管間存在的顏色差異。至培養結束，空白培養基變為藍綠色，陽性對照管為淡黃綠色，顏色越黃，pH 值相對越低。

菌液顏色變化情況結果如圖2 所示。

圖2 菌液顏色變化情況Fig. 2 Color change of bacterial liquid

2.3 菌液顏色變化與產酸的對應關系

對經過離心管組鑒別培養得到的混合液，先進行種液培養，再轉接入發酵培養基中進行發酵培養和產酸檢測，考察鑒別培養基中菌液顏色變化與2- 酮基- L- 古龍酸生成量是否存在對應關系。

菌株編號原則為單菌落首次發生變色的時間-菌落序號。菌液顏色變化與產酸對應關系的檢測結果見表1。

表1 菌液顏色變化與產酸對應關系Table 1 Corresponding relationship between color change of bacterial liquid and acid production

菌液出現顏色變化的程度與其產酸能力的對應 趨勢如圖3 所示。

圖3 顏色變化的程度與產酸能力的對應趨勢Fig. 3 Corresponding trend between the degree of color change and acid prodution capacity

由表1、圖3 可以看出，在鑒別固體培養中，最早出現變色圈的菌株K56- 1、K56- 2 在種液鑒別培養過程中也率先產生顏色變化，且種液最早出現變色的K56- 1 黃色最深，種液和發酵瓶培養產酸量也相對最高。結果反映出種液變黃的時間和程度與菌株的產酸量呈現一定的對應關系。

2.4 速生菌株的發酵數據驗證

2.4.1 搖瓶發酵對比確定速生型菌株

將初篩得到的鑒別培養變色較早、產酸相對較高的K56- 1、K56- 2、K64- 1、K64- 2 4 個菌株與對照菌株進行搖瓶發酵對比實驗，確定速生型菌株。

首先制備上述菌株的大菌和小菌混合斜面，用接種環分別刮取一環菌苔，接入100 mL/500 mL 三角瓶種液培養基中，在30±2 ℃、200 r/min 條件下培養19 h，完成種液制備。

再吸取5 mL 種液，轉接入40 mL/500 mL 三角瓶發酵培養基中進行搖瓶發酵對比，測定不同時期的產酸量。

搖瓶發酵對比數據結果見表2。

表2 搖瓶發酵對比數據Table 2 Comparison data of shake flask fermentation

由表2 可以看出，經過3 批次的對比實驗，菌株K56- 1 生長產酸具有明顯優勢，選定將該菌株作為速生型新菌種進行發酵驗證。

2.4.2 發酵數據驗證

利用2 個50 L 發酵罐，將速生型菌種K56- 1與生產對照菌種進行平行實驗，發酵驗證數據結果見表3。

表3 發酵驗證數據Table 3 Fermentation verification data

由表3 可以看出，K56- 1 平均發酵的周期縮短2.38 h， 產酸速率提高0.18 mg/ (mL·h)， 約占7.23%，驗證了新菌種K56- 1 具有速生、產酸快的性能優勢。

3 結果討論

近年來，基于熒光信號的高通量篩選，以及迅速發展的超高通量FACS 和DMFS ，已成為酶和細胞工廠改造中最新應用。

Liu Yongfei 等人通過建立色氨酸特異性適配體生物傳感器和熒光激活液滴分選技術，篩選到色氨酸高產菌株。

本研究根據普通產酮基古龍酸菌在生長代謝過程中可將底物山梨糖氧化生成2- 酮基- L- 古龍酸，使反應體系pH 值下降的特點，開發了指示劑鑒別檢測方法，并利用離心管所具備的密閉性好、高溫滅菌、避免孔板培養無法確保無菌度的弱點、可振蕩培養滿足菌株的好氧需求等優勢，實現了普通產酮基古龍酸菌速生菌株的高通量篩選。

4 結 語

實驗結果證實本研究建立的指示劑鑒別檢測的方法可行，菌株生長產酸情況與培養基顏色變化存在一定的對應關系，可用于普通產酮基古龍酸菌的篩選。

離心管組合培養技術既可滿足單管獨立進行無菌操作和振蕩培養需求，又可組合進行批量培養和檢測，達到了快速便捷的高通量篩選目的。

通過此方法選育得到了生長快、產酸高的速生型普通產酮基古龍酸菌株K56- 1，經過發酵驗證，與對照菌種相比，其發酵平均周期縮短2.38 h，2- KGA 生成速率提升7.23%。