庫侖滴定法測定鹽酸表柔比星緩釋片水分

張勇強，劉蘭俠，朱方建，劉忠明，李玉勤，宦 娣

(蚌埠市第一人民醫院，安徽 蚌埠 233000)

表柔比星屬于抗生素類抗腫瘤藥，抑制DNA和RNA的合成，對多種移植性腫瘤均有效。[1-2]鹽酸表柔比星緩釋片是一種的長效低毒的新型緩釋制劑，該制劑由表柔比星和生物可降解高分子材料組成，表柔比星和輔料具有較強的引濕性，緩釋片在制備、存儲過程中易吸潮，影響制劑的穩定性，進而影響制劑的質量。

對于鹽酸表柔比星緩釋片，目前國內尚沒有法定的水分測定方法。目前國內常使用的水分測定方法有卡爾費休容量法測定法，減壓干燥法，烘干法、甲苯法等[3-13]。但是這些方法對于測定鹽酸表柔比星緩釋片水分都有其不足之處，如成本高，檢測不準確等問題?？紤]到制劑的檢測成本以及精密性和可操作性，故有必要建立一種穩定、準確、靈敏的鹽酸表柔比星緩釋片水分的檢測方法，用于控制本品中的水分。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

微量水分測定儀(山東三泵科森儀器有限公司)；旋渦混合儀(上海蘭儀實業有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號XA105DU)；微量進樣器：0.5μL、250μL、500μL氣相尖頭進樣針(澳大利亞SGE公司)。

1.2 試劑及材料

N-N-二甲基甲酰胺(分析純)(上海優試化工有限公司)；無水甲醇(分析純)(國藥化學試劑有限公司)；電量法卡爾費休試劑(電解液)[格里斯(天津)醫藥化學技術有限公司]。

純化水(實驗室自制)；1.5mL液相色譜進樣瓶(上海雷布斯生物科技有限公司)；5A型分子篩(國藥化學試劑有限公司)；鹽酸表柔比星緩釋片：實驗室自制(批號20190302，20190504，20190809，20191012)。

2 方法和結果

2.1 配制混合溶劑

量取N-N-二甲基甲酰胺(DMF)400mL于試劑瓶中，加入無水甲醇100mL，再加入適量分子篩，混勻，加蓋，密封，待用。

2.2 空白溶劑制備

根據“2.1”項下方法配制混合溶劑500mL，渦旋10min，為空白溶劑樣。

2.3 供試品制備

取鹽酸表柔比星緩釋片約20mg，精密稱定，置進樣瓶中，向進樣瓶加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶劑，渦旋10min，使鹽酸表柔比星緩釋片完全溶解，即得供試樣。

2.4 儀器平衡

將“2.1中配制的混合溶劑”作為電解液用注射器(必須干凈、干燥)通過密封口注入到微量水分測定儀的陽極室內，液面高度位于上下刻度線之間(約120mL)，同法向陰極室注入適量試劑，兩室液面高度要保持一致。按規定組裝微量水分測定儀，完成后，打開電源，開始攪拌。儀器此時為測量短路狀態，分多次向陽極室注入少量純化水，儀器從測量短路狀態變為過碘狀態，再多次加入少量純化水，直到儀器工作電壓曲線接近為零點，并達到水平平衡為止。

2.5 儀器標定

當儀器達到初始平衡點且比較穩定時，用0.5μL進樣器精密抽取0.1μL的純化水，點擊開始，然后把純水注入到陽極室內(針尖需插入液面以下)，蜂鳴器響，信息提示測試完畢，連續標定3次，結果需為100±3μg，RSD<3%。結果見表1。

表1 儀器標定結果

2.6 線性關系考察

精密稱取8份鹽酸表柔比星緩釋片(批號20190302)，每份約20mg，依次置進樣瓶中，編號1～8號，分別向進樣瓶中精密加入DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶劑500μL，再向1～8號進樣瓶依次分別精密加入0μL、0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL、1.5μL純化水作為線性標曲樣品，所有樣渦旋10min。依次分別精密吸取空白溶劑樣、1～8號樣品250μL注入陽極室進行檢測。空白溶劑樣檢測結果見表2，線性標曲樣品檢測結果見表3。

表2 空白溶劑檢測結果

表3 線性供試樣檢測結果

以表3中制劑含水量(試樣理論含水量)為X軸，儀器檢測(檢測水量)值為Y軸作散點圖，再用加權最小二乘法進行線性回歸。得回歸方程為Y=0.4658X+155.2720(X為制劑含水量，Y為儀器檢測水量)；相關系數r=0.999 8，所以該檢測方法在制劑水分0%～8%內具有較好的線性關系。

2.7 定量限

2015版《中國藥典》藥品質量標準分析方法驗證規定量限可按照LOQ=10δ/S公式計算。式中LOQ：定量限；δ：響應值的偏差；S：標準曲線的斜率。δ可通過下列方法測得：測定空白值的標準偏差；采用標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替。由表2和回歸方程相關數據得，δ=1.29 ，S=0.4658，分別代入計算得：

LOQ=10δ/S=10×1.29/0.465 8=27.7(μg)

考慮到鹽酸表柔比星緩釋片中含水量較少，且供試溶液中含水量越少越容易受到環境影響，我們將定量限LOQ定為100μg。

2.8 重復性考察

精密稱取鹽酸表柔比星緩釋片(批號20190302)5份，每份約20mg，分別置于各進樣瓶中，編號1～5號，每只進樣瓶分別精密加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶劑，渦旋溶解10min。用空白溶液或供試液潤洗250μL微量進樣器，分別精密吸取250μL注入陽極室進行檢測，檢測結果見表4。

表4 鹽酸表柔比星緩釋片精密度檢測結果

表4實驗數據顯示：鹽酸表柔比星緩釋片精密度檢測平均水分為0.60%，RSD為1.91%。精密度符合要求。

2.9 準確度考察

精密稱取鹽酸表柔比星緩釋片(批號20190302)18份，每份約20mg，編號1～18號，分別置于各進樣瓶中，每只進樣瓶分別精密加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶劑，1～6號為低水分樣，分別向7～12號進樣瓶中精密加入0.4μL(400μg)純化水，為中水分樣；再分別向13～18號進樣瓶中精密加入0.7μL(700μg)純化水，為高水分樣。渦旋混勻后，再向4～6號進樣瓶中精密加入0.2μL(200μg)純化水，為低水分加標樣；向10～12號進樣瓶中分別精密加入0.5μL(500μg)純化水，為中水分加標樣，再分別向16～18號進樣瓶中精密加入0.8μL(800μg)純化水，為高水分加標樣，將所有樣品渦旋3min。另取3個1.5mL進樣瓶，分別精密加入500mL混合溶劑，渦旋3min，為空白溶劑樣。用空白溶液或供試液潤洗250μL微量進樣器，分別精密吸取250μL注入陽極室檢測，空白溶劑樣、1～18號供試樣依次檢測。檢測結果見表5和表6。

表5 鹽酸表柔比星緩釋片準確度未加標樣檢測結果

表6 鹽酸表柔比星緩釋片加樣回收率檢測結果

實驗數據顯示：鹽酸表柔比星緩釋片低、中、高樣品平均回收率分別為102.80%、98.50%和98.40%，檢測結果均符合要求。

2.10 結果

分別對20190504、20190809和20191012批次鹽酸表柔比星緩釋片按照“2.2供試品制備方法”進行制備，每批平行樣3份。制備好后，分別精密吸取相應的供試品250μL注入陽極室進行檢測。3批鹽酸表柔比星緩釋片水分測定結果見表7。

表7 三批制劑測定結果

3 討論

3.1 方法的選擇

參考2015版《中國藥典》，鹽酸表柔比星原料藥的水分測定的方法選擇的是卡爾費休容量法[13]；在前期試驗中發現，我們選擇卡氏容量法進行檢測，測得3批鹽酸表柔比星緩釋片水分含量分別為0.61%，0.61%，0.58%，RSD分別為2.46%，1.95%，2.56%(n=3)；這兩種方法檢測的結果相差不大。但是容量法每次檢測需要消耗10g左右的制劑，由于表柔比星為貴重藥品，價格昂貴，這種方法檢測成本較高。而對于水分測定的其他方法，如減壓干燥法、烘干法、甲苯法等，考慮到其靈敏度、準確度以及適應性，并不適合用于鹽酸表柔比星緩釋片的水分含量的測定。所以我們需要找到一種既能準確、穩定檢測緩釋片中的水分，又能降低檢測成本的水分測定方法?？ㄊ蠋靷惖味ǚㄖ饕糜跍y定含微量水分(0.000 1%～0.1%)的供試品，特別適用于測定化學惰性物質如烴類、醇類和酯類中的水分[15-16]?？ㄊ蠋靵龇ㄔ谝淮螜z測中可以只需要消耗200mg制劑消耗量，大大降低了檢測成本，但又不影響檢測結果的準確度和精密度，非常適合作為鹽酸表柔比星緩釋片的水分檢測方法。

3.2 檢測的專屬性

卡氏庫侖法可適用多種有機和無機物中的水分測定，但由于各種化合物性質存在的差異，只有在卡氏試劑中無副反應無干擾的情況下，卡氏庫侖法測定才是一種專屬性的方法。其檢測的原則是：1.副反應不能生成水；2.樣品也不能消耗碘或釋放碘。在檢測中主要引起副反應和產生干擾的物質有：1.鹽、氫氧化物和氧化物；2.酮和醛；3.強酸；4.硅烷醇/硅氧烷；5.含硼化合物；6.金屬過氧化物；7.消耗碘的物質，如鐵鹽、銅鹽、亞硝酸鹽、硫代硫酸鹽；8.強氧化劑。而鹽酸表柔比星緩釋片中的原料藥鹽酸表柔比星以及輔料聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)均不屬于這八類物質，所以卡爾費休庫倫法檢測鹽酸表柔比星緩釋片中水分具有較強的專屬，可用于制劑水分的測定。

3.3 溶劑的選擇

溶解溶劑應選擇實驗常用有機溶劑，水分測定一般都使用無水甲醇作為溶劑。表柔比星原料藥以及輔料聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在甲醇中具有較大的溶解度，但輔料PLGA不溶于甲醇，實驗發現PLGA在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中有較好的溶解度。通過鹽酸表柔比星緩釋片在無水甲醇和DMF中溶解性實驗發現：先用甲醇溶解鹽酸表柔比星緩釋片再加入適量DMF和先用DMF溶解鹽酸表柔比星緩釋片再加入適量甲醇短時間內均能使溶液由渾濁變澄清。且單純的DMF溶劑鹽酸表柔比星緩釋片渦旋幾分鐘仍不能使溶液澄清，所以選擇DMF、甲醇混合溶劑溶解鹽酸表柔比星緩釋片。配制DMF∶甲醇為1∶4、2∶3、5∶5、3∶2、4∶1(v/v)五種不同比例的混合溶劑，分別溶解一定量鹽酸表柔比星緩釋片。實驗發現：DMF∶甲醇=4∶1(v/v)時緩釋片從破碎溶解到溶液澄清透明所需時間最短，溶解效果最好；所以選擇DMF、甲醇4∶1(v/v)混合溶劑溶解鹽酸表柔比星緩釋片。

3.4 進樣方式

鹽酸表柔比星緩釋片為固體制劑，可以選擇固體進樣或液體進樣。固體進樣需要將鹽酸表柔比星緩釋片在滴定池中溶解，但鹽酸表柔比星緩釋片不能完全溶解于電解液(電量法卡爾費休試劑)中，所以無法準確測量，并且加入固體制劑時需打開進樣口塞，會導致大量水蒸氣進入滴定池，對檢測結果產生影響。只有將鹽酸表柔比星緩釋片先用溶劑溶解，再精密吸取一定量供試液，通過微量進樣針穿刺進樣口膠塞將液體加入到滴定池中。液體進樣能夠避免制劑不溶于電解液的困難，且可以減少進入滴定池的水蒸氣，使檢測結果更加準確。

3.5 稱量質量及溶解時間的選擇

由于鹽酸表柔比星緩釋片含水量較低，容易受環境影響，增大了隨機誤差，故我們需要稱取較大的藥量進行操作減小誤差。我們稱取3份鹽酸表柔比星緩釋片(20mg、30mg、40mg)分別置于3個1.5mL進樣瓶中，再分別加入500μL混合溶劑，渦旋溶解觀察現象。實驗發現：3份鹽酸表柔比星緩釋片都能在500μL混合溶劑中快速崩解，渦旋1min后已基本全部溶解，渦旋10min后制劑消失，全部溶解。靜置1min后，溶液均澄清透明，20mg樣品無沉淀，30mg樣品有少許沉淀，40mg樣品有較多沉淀。所以檢測時我們選擇稱取制劑20mg，渦旋溶解時間為10min。

4 小結

實驗表明庫侖滴定法測量鹽酸表柔比星緩釋片方法適用、穩定、可靠；水分含量在0%～8%范圍內，制劑水分含量與儀器檢測值呈良好的線性關系(r>0.999 8)。檢測方法具有良好的準確度、精密度，并且能夠有效減少檢測過程中制劑的消耗，可以用于定量檢測鹽酸表柔比星緩釋片中的水分含量。