黃芪多糖聯合格列美脲對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠認知功能障礙的保護作用

吳堅，付瑛

1.贛州市人民醫院，江西 贛州 341000；2.青島市市立醫院，山東 青島 266500

糖尿病是一種長期血糖水平增高為特征的代謝性疾病，由于胰島素絕對或相對不足及靶細胞對胰島素敏感性降低引起的代謝紊亂綜合征，常伴嚴重的并發癥，嚴重影響著人們的生活質量。糖尿病中樞神經系統并發癥是糖尿病常見并發癥之一，可導致患者認知功能障礙，甚至發展為癡呆［1-2］。相關資料顯示，60%～70%的糖尿病患者在疾病晚期存在不同程度認知功能障礙，但其導致認知功能障礙的神經內分泌機制尚不明了［3］。糖尿病認知功能障礙患者常表現為學習、記憶功能的減退，導致生活、社交及工作能力的降低甚至喪失，因此如何預防或延緩糖尿病認知功能障礙的發生具有重要意義。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，具有雙向調節血糖的作用，可通過調節機體細胞免疫、體液免疫及細胞因子活性在糖尿病及其并發癥治療中發揮著重要作用，并可通過多途徑延緩糖尿病并發癥的發生發展［4］。格列美脲是新型第三代磺酰脲類降糖藥，可刺激胰島素分泌和釋放，改善胰島素抵抗，還可促進肌肉組織對外周葡萄糖的攝取，降低血糖［5］。本研究分析黃芪多糖聯合格列美脲對糖尿病小鼠認知功能障礙的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

鏈脲佐菌素（上海明萱生物科技有限公司）；黃芪多糖（上海韻泰信息科技有限公司）；格列美脲（北京伊塔生物科技有限公司）；戊巴比妥鈉（中國醫藥集團上海化學試劑公司）；DAB 顯色試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（哈爾濱新海基因檢測有限公司）；MDA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；SOD 試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；葡萄糖測定試劑盒（艾美捷科技有限公司）。

高壓蒸汽滅菌器（北京佳源興業科技有限公司）；恒溫水浴箱（上海輔澤商貿有限公司）；臺式冷凍離心機（杭州諾丁科學器材有限公司）；凝膠圖像處理系統（上海輔澤商貿有限公司）；全自動酶標儀（北京安麥格貿易有限公司）；磁力攪拌器（北京益奧柏科貿有限公司）；熒光正置顯微鏡（廣州科適特科學儀器有限公司）；Morris 水迷宮（上海玉研科學儀器有限公司）；腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；全自動生化分析儀（上海帝博思生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物造模及分組

選取雄性SPF 級ICR 小鼠40 只，6～8 周齡，體質量18～22 g，購于北京維通利華動物實驗技術有限公司，所有動物實驗均遵循國家動物飼養和使用指南，飼養于動物實驗中心7 d，自由飲水攝食以適應周圍實驗環境。隨機選取10 只小鼠為正常對照組，其余小鼠采用高脂飼料喂養4 周后，給予小劑量鏈脲佐菌素（STZ）40 mg/kg 腹腔注射，建立糖尿病小鼠模型，72 h 檢測小鼠空腹血糖≥13.88 mmol/L 即為造模成功。將造模成功的小鼠隨機分為模型組、格列美脲組、黃芪多糖聯合格列美脲組（聯合組），格列美脲組給予灌胃給藥0.5 mg·kg-1·d-1，聯合組給予灌胃給藥黃芪多糖400 mg·kg-1·d-1、格列美脲0.5 mg·kg-1·d-1；正常對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，連續6 周。

1.3 檢測方法

（1）體質量、空腹血糖：連續給藥6 周后，測定小鼠體質量和空腹血糖，計算每組小鼠平均體質量和空腹血糖。（2）Morris 水迷宮實驗：水迷宮為150 cm×50 cm×30 cm 的圓形水池，分為4 個象限，在距池壁一定距離的池內任何一個象限，在水面以下2 cm 處放置一個直徑10 cm 的平臺，并在水中加入墨汁，防止動物在清水下看平臺。隱藏平臺實驗：每只小鼠分別從不同象限面朝池壁入水，記錄尋找平臺的逃逸潛伏期，并考察其學習能力。記錄時間為90 s，如果在90 s 內沒有發現平臺，則將小鼠引導至平臺并熟悉平臺20 s。空間探索實驗：取下平臺后，將小鼠從平臺對側入水點放入水池，記錄小鼠在90 s 內穿越平臺次數，測試其記憶能力。（3）透射電鏡：10%水合氯醛麻醉小鼠，收集胰腺尾部和海馬組織，切成1 mm×1 mm×1 mm 大小，置于2.5%戊二醛中固定，組織經梯度脫水后用環氧樹脂固定。超薄切片經200 目篩，用醋酸雙氧鈾和醋酸鉛染色，透射電鏡觀察各組小鼠胰島β 細胞、海馬組織神經元超微結構。（4）海馬組織葡萄糖依賴性促胰島素多肽（glucose dependent insulinotropic peptide，GIP）和胰高血糖素樣肽-1（gucagon like peptide-1，GLP-1）檢測：根據默克密理博Milliplex MAP 試劑盒說明檢測各組小鼠海馬組織GIP、GLP-1 含量。（5）腦組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量：采用硫酸巴比妥法檢測各組小鼠腦組織SOD 活力、黃嘌呤氧化酶法檢測MDA 含量。

1.4 統計學方法

本研究數據均采用SPSS 21.0 軟件進行分析，計量數據均采用表示，采用單因素方差分析多組間數據的比較，兩組間數據比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量、血糖的變化比較

給藥處理后，格列美脲組、聯合組小鼠體質量較模型組明顯升高，空腹血糖較模型組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），且聯合組小鼠體質量明顯高于格列美脲組、空腹血糖明顯低于格列美脲組（P<0.05），見表1。

表1 各組小鼠體質量、血糖的變化比較（）

表1 各組小鼠體質量、血糖的變化比較（）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與格列美脲組比較，cP<0.05。

2.2 各組小鼠空間學習記憶能力比較

Morris 水迷宮實驗顯示，自第4 天開始格列美脲組、聯合組小鼠逃避潛伏期明顯短于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）；格列美脲組、聯合組小鼠穿越平臺次數明顯高于模型組（P<0.05），且聯合組明顯高于格列美脲組（P<0.05）。見圖1、2。

圖1 各組小鼠逃避潛伏期

圖2 各組小鼠穿越平臺次數

2.3 各組小鼠胰島β 細胞超微結構的變化比較

透射電鏡下觀察發現，正常對照組胰島β 細胞含豐富的胰島素分泌顆粒，核膜完整，核染色質分布均勻；模型組胰島β 細胞分泌顆粒減少，線粒體嵴斷裂，空泡現象增多；格列美脲組可見少量胰島β 細胞粗面型內質網擴張及空泡現象；聯合組胰島β 細胞胞質內粗面型內質網及核糖體較為豐富，可見較多分泌顆粒，核染色質分布均勻。見圖3。

圖3 透射電鏡下觀察胰島β細胞超微結構（400倍鏡）

2.4 各組小鼠海馬神經元超微結構變化比較

正常對照組海馬神經元核膜清晰，常染色質豐富，核質均勻，線粒體膜光滑，嵴板狀或管泡狀；模型組細胞膜不規則，染色質凝集，細胞質溶解，變性線粒體、膜不清，嵴致密；格列美脲組細胞膜斷續不明顯，核膜部分規整，有常染色質分布，有的嵴斷裂，局部呈空泡狀；聯合組細胞膜連續，核膜完整，常染色質較多且均勻，線粒體大小不等，嵴斷裂呈空泡狀。見圖4。

圖4 透射電鏡下觀察海馬神經元超微結構（400倍鏡）

2.5 各組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1 的含量比較

模型組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1 含量明顯低于正常對照組（P<0.05），格列美脲組、聯合組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1 含量明顯高于模型組（P<0.05），且聯合組明顯高于格列美脲組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1的含量比較（pg/mg，）

表2 各組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1的含量比較（pg/mg，）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與格列美脲組比較，cP<0.05。

2.6 各組小鼠腦組織中MDA、SOD 含量比較

模型組小鼠腦組織中MDA 含量明顯高于正常對照組、SOD 活性低于正常對照組（P<0.05），格列美脲組、聯合組小鼠腦組織中MDA 含量明顯低于模型組、SOD 活性高于模型組（P<0.05），聯合組對MDA、SOD 改善明顯優于格列美脲組（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腦組織中MDA、SOD含量比較（）

表3 各組小鼠腦組織中MDA、SOD含量比較（）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與格列美脲組比較，cP<0.05。

3 討論

糖尿病是引發認知功能障礙的獨立危險因素，但具體發病機制尚不清楚，其中代謝異常、高血糖、胰島素信號通路異常、內質網應激、神經元鈣穩態失衡和突觸可塑性。血腦屏障損傷等均參與其中，組成了復雜的發病機制。黃芪多糖是黃芪的重要成分，具有增強免疫、抗炎及降血糖等多種藥理作用［6-7］。已有研究證實用于糖尿病及并發癥中黃芪多糖具有改善胰島素抵抗、減輕機體內氧化應激水平、調節機體免疫功能等多種作用［8］。臨床上，黃芪多糖可通過改善糖代謝，降低轉化生長因子β1來治療糖尿病腎??；并可增強腫瘤放化療患者的免疫力，起到輔助治療的作用［9］。有學者通過研究發現，黃芪多糖可顯著提高2 型糖尿大鼠胰島素敏感性，降低胰島素抵抗大鼠脂肪組織中抵抗素蛋白的表達，有望成為新的中藥類胰島素增敏劑和脂質代謝調節劑［10］。格列美脲為第三代長效口服磺脲類降糖藥，治療糖尿病具有安全性高、有效藥物作用持續時間長等優點，對單用胰島素血糖控制不佳者效果尤為明顯。格列美脲藥物治療機制在于其可與胰島β 細胞表面的磺酰尿受體結合，促進胰島β細胞分泌胰島素，進而增加外周組織對胰島素的敏感，抑制肝臟葡萄糖的合成；并可通過血腦屏障進入大腦參與能量代謝［11-12］。有學者通過研究發現，采用STZ 建立糖尿病小鼠模型后并給予格列美脲進行干預，結果顯示格列美脲可明顯改善糖尿病小鼠空間學習和記憶能力，且機制是通過降血糖作用而達成的［13］。本研究采用黃芪多糖聯合格列美脲對糖尿病小鼠進行干預，發現可明顯降低小鼠空腹血糖水平，且效果優于單一使用格列美脲。此外本研究在Morris 水迷宮實驗結果中發現，格列美脲組、聯合組小鼠逃避潛伏期明顯短于模型組，小鼠穿越平臺次數明顯高于模型組（P<0.05），提示黃芪多糖聯合格列美脲明顯改善STZ 所誘導的糖尿病小鼠的學習記憶能力。

海馬結構和功能完整性與學習記憶的鞏固密切相關，海馬的損傷通常影響記憶的形成，與認知衰退相關的神經退行性病變存在密切聯系［14］。本研究通過透射電鏡發現模型組細胞膜不規則，染色質凝集，細胞質溶解，變性線粒體、膜不清，嵴致密；聯合組細胞膜連續，核膜完整，常染色質較多且均勻，線粒體大小不等，嵴斷裂呈空泡狀。由此可見黃芪多糖聯合格列美脲可改善STZ 誘導的糖尿病小鼠海馬神經元結構，緩解海馬區神經元結構損傷。GIP 是一種腸道內K 細胞分泌的腸促胰素，可促進胰島β 細胞第一時相分泌胰島素；GLP-1 是腸道L細胞分泌的腸促胰素，可抑制胰高糖素和促進葡萄糖在組織中的代謝。GIP、GLP-1 在突出可塑性的控制和記憶形成中發揮著重要作用［15-16］。本研究檢測海馬組織中GIP、GLP-1 含量發現，格列美脲組、聯合組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1 含量明顯高于模型組（P<0.05），且聯合組明顯高于格列美脲組（P<0.05），提示黃芪多糖聯合格列美脲明顯改善糖尿病小鼠海馬組織GIP、GLP-1 含量，可能為改善小鼠空間學習記憶的機制之一。此外本研究還發現，格列美脲組、聯合組小鼠腦組織中MDA 含量明顯低于模型組、SOD 活性高于模型組（P<0.05），提示黃芪多糖聯合格列美脲可通過降低糖尿病小鼠腦組織氧化應激程度改善海馬神經元超微結構，進而改善糖尿病認知功能障礙。

綜上所述，黃芪多糖聯合格列美脲可通過提高海馬組織GIP、GLP-1 含量及抗氧化能力，進而緩解糖尿病導致的認知功能障礙，為糖尿病認知功能障礙的防治提供新的靶點。