miR-100-5p對胃癌細胞增殖、轉移和化療耐藥的作用及機制研究

雷 益，李紹軍，胥錢平，馮 成，杜麗英

胃癌是常見惡性腫瘤，為與腫瘤相關死亡的第三大原因，2018年估計有783 000例胃癌患者死亡[1]。化療、放療和胃切除術是治療胃癌的主要方法，盡管近年這些治療方法的實施取得了長足進步，但胃癌晚期患者總體5年生存率仍不到30%[2]。目前，晚期轉移和化療耐藥仍是胃癌患者治療的主要障礙[3]。因此，胃癌分子機制研究是探討胃癌新治療策略的重要途徑。miRNA是非編碼RNA之一，雖然不具備編碼功能，但是其在腫瘤等疾病中的作用逐漸被挖掘[4]。miR-100-5p是與腫瘤密切相關的miRNA之一，可發揮抑癌作用和促癌作用。有研究顯示，miR-100-5p在前列腺癌、肝細胞肝癌和非小細胞肺癌等腫瘤中表達異常，不僅與腫瘤增殖和轉移密切相關，還可調控腫瘤細胞耐藥[5-7]。Chen等[8]報道miR-100-5p通過抑制mTOR信號通路參與長鏈非編碼RNA HAGLROS促進胃癌惡性進展，但是miR-100-5p在胃癌中的表達及發揮的具體生物學功能現仍未知。因此，本研究探討miR-100-5p對胃癌細胞增殖、轉移和化療耐藥的作用及機制，旨在獲得miR-100-5p抗胃癌治療的潛在分子靶點。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月—2019年6月于四川大學華西醫院眉山醫院行根治性手術的胃癌患者標本，收集經病理檢查證實的胃癌組織和癌旁組織(距離腫瘤5 cm的非胃癌組織)，患者術前未接受過任何形式治療并簽署相關知情同意書，共納入70例。70例中男37例，女33例；年齡≤60歲28例，>60歲42例；腫瘤直徑：<5 cm 50例，≥5 cm 20例；分化程度：高分化12例，中分化15例，低分化43例；淋巴結轉移：有39例，無31例；Duke分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期20例，Ⅲ期24例，Ⅳ期8例。患者術后進行以鉑類為主的一線化療，化療方案為奧沙利鉑第1天和第7天100 mg/m2靜脈滴注2 h，7 d為1個療程，共化療5個療程。隨訪追蹤患者治療后效果，主要包括復發和疾病進展，70例中化療有效37例，無效33例。

1.2試劑和材料 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，miR-100-5p和內參U6引物由上海生工試劑公司合成，胰蛋白酶、細胞培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司，胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1購自中國科學院細胞庫，miR-100-5p mimic購自廣州瑞博生物試劑有限公司，MTS試劑和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司，RIPA裂解液購自上海貝博生物科技公司，PVDF膜購自美國Bio-Rad，ERK1/2、pERK1/2和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司，ECL化學發光試劑盒購自上海慧穎生物科技有限公司。

1.3qRT-PCR 在胃癌組織和癌旁組織中加入Trizol裂解液于研缽中研磨裂解，采用RNA提取試劑盒提取組織中總的RNA。采用UltraRT One-step RT-PCR試劑盒進行RNA逆轉錄和qRT-PCR，其體系為10X One Step RT-PCR Buffer 1 μl、上下游引物各0.4 μl、RNA 0.2 μg、RNase mimic 0.1 μl、AMV RT 0.1 μl、Taq DNA polymerase和無RNA酶的雙蒸水補足10 μl。反應條件為逆轉錄45 ℃20 min、94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s 30個循環，72 ℃終延伸10 min。miR-100-5p引物F：5'-GAACCCGTAGATCCGAACT-3'，R：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6引物F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照2-ΔΔCt公式以U6為內參計算miR-100-5p的相對表達量。

1.4細胞培養和細胞轉染 采用含有10%胎牛血清的培養基培養胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1，并放置在37 ℃含有5%CO2的全濕度培養箱中。采用胰酶消化進行細胞傳代。細胞長滿時收集細胞，提取細胞總RNA。采用qRT-PCR檢測各細胞中miR-100-5p的表達。選取miR-100-5p表達最低的細胞系進行細胞接種，以每孔2×105個細胞接種至6孔板中，分為NC組和miR-100-5p mimic組，細胞貼壁12 h后進行細胞轉染，NC組轉染脂質體2000與對照mimic混合液，miR-100-5p mimic組轉染脂質體2000與miR-100-5p mimic混合液，轉染培養48 h后采用qRT-PCR檢測細胞中miR-100-5p的表達。

1.5MTS實驗檢測細胞增殖能力 NC組和miR-100-5p mimic組細胞以每孔2000個接種至96孔板中，每組設置6個重復孔，分別在貼壁0、24、48和72 h時，每孔更換100 μl培養基和20 μl MTS試劑，繼續在培養箱中培養2 h，采用全波長掃描儀檢測細胞在490 nm處的OD值。

NC組和miR-100-5p mimic組細胞以每孔2000個接種至96孔板中，每組設置6個重復孔，細胞貼壁后分別加入不同劑量的奧沙利鉑(0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)處理細胞48 h。每孔更換100 μl培養基和20 μl MTS試劑，繼續在培養箱中培養2 h，采用全波長掃描儀檢測細胞在490 nm處的OD值。細胞增殖率=miR-100-5p mimic組平均OD值/NC組平均OD值×100%。

1.6Transwell實驗檢測細胞轉移能力 NC組和miR-100-5p mimic組細胞胰酶消化后，無血清培養基洗3次，以每孔1×105個接種至24孔板Transwell小室膜中，24孔板Transwell下室中加入含有500 μl 10%胎牛血清的培養基，每組設置3個重復孔，培養箱中培養10 h，細胞可穿過Transwell小室膜貼在膜下室面，終止細胞培養。膜下室面細胞經PBS洗3次、甲醇固定及吉姆薩染色后在顯微鏡下計數細胞穿膜數目。

1.7流式細胞凋亡實驗檢測細胞凋亡率 NC組和miR-100-5p mimic組細胞經無EDTA的胰酶消化后，PBS洗3次，以每管5×105個收集到流式細胞管中，按照凋亡染色試劑盒說明書，加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI細胞重懸混勻。常溫孵育10 min進行染色，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。

NC組和miR-100-5p mimic組細胞經奧沙利鉑不同濃度處理48 h后，經無EDTA的胰酶消化后，PBS洗3次，以每管5×105個收集到流式細胞管中，按照凋亡染色試劑盒說明書，加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI細胞重懸混勻。常溫孵育10 min進行染色，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。

1.8Western blotting檢測ERK1/2和pERK1/2蛋白表達 NC組和miR-100-5p mimic組細胞收集后加入RIPA裂解液，于冰上裂解細胞30 min，14 000 r/min 4 ℃離心30 min后，獲得細胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸變性。蛋白80 V凝膠電泳2 h、350 mA濕轉2 h、5%封閉液室溫封閉1 h，與ERK1/2和pERK1/2一抗(稀釋度均為1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，采用ECL化學發光試劑盒進行蛋白條帶曝光。

2 結果

2.1胃癌組織和癌旁組織中miR-100-5p表達 qRT-PCR檢測結果顯示，miR-100-5p在胃癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為1.05±0.36和1.69±0.72，miR-100-5p的相對表達量胃癌組織低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測胃癌組織和癌旁組織中miR-100-5p相對表達量

2.2miR-100-5p表達與胃癌患者臨床病理參數關系 miR-100-5p表達與胃癌患者性別、年齡、腫瘤直徑和分化程度無關(P>0.05)；與胃癌患者淋巴結轉移、TNM分期和化療效果相關(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 miR-100-5p表達與胃癌患者臨床病理參數關系

2.3胃癌細胞系及人正常胃黏膜上皮細胞系中miR-100-5p表達 qRT-PCR檢測結果顯示，miR-100-5p在胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1中的相對表達量分別為1.31±0.14、1.34±0.15、0.39±0.07和2.94±0.29。miR-100-5p相對表達量胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1總體比較差異有統計學意義(P<0.01)；miR-100-5p相對表達量胃癌細胞系GES-1、MKN1和MKN45均低于人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測胃癌細胞系及人正常胃黏膜上皮細胞系中miR-100-5p相對表達量

2.4miR-100-5p mimic轉染效果 miR-100-5p mimic轉染胃癌細胞MKN45，qRT-PCR檢測結果顯示，NC組和miR-100-5p mimic組細胞中miR-100-5p相對表達量分別為1.00±0.06和5.42±0.27。細胞中miR-100-5p相對表達量miR-100-5p mimic組高于NC組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 qRT-PCR檢測miR-100-5p mimic轉染效果

2.5miR-100-5p對MKN45細胞增殖能力影響 MTS實驗檢測結果顯示，MKN45細胞增殖能力miR-100-5p mimic組低于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 MTS實驗檢測miR-100-5p對MKN45細胞增殖能力影響

2.6miR-100-5p對MKN45細胞轉移能力影響 Transwell實驗檢測結果顯示，MKN45細胞穿膜細胞數NC組和miR-100-5p mimic組分別為(49.33±7.35)個和(21.67±5.84)個，MKN45細胞穿膜細胞數miR-100-5p mimic組少于NC組，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 Transwell實驗檢測miR-100-5p對MKN45細胞轉移能力影響(吉姆薩染色×100)

2.7miR-100-5p對MKN45細胞奧沙利鉑化療敏感性影響 NC組和miR-100-5p mimic組MKN45細胞經不同濃度奧沙利鉑處理，培養48 h后MTS實驗檢測結果顯示在同一奧沙利鉑濃度處理下，細胞增殖率miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。流式細胞凋亡實驗檢測結果顯示，NC組細胞凋亡率為(2.14±0.15)%，miR-100-5p mimic組細胞凋亡率為(7.06±0.27)%。MKN45細胞對奧沙利鉑化療敏感性miR-100-5p mimic組較NC組增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 miR-100-5p對MKN45細胞奧沙利鉑化療敏感性影響

2.8miR-100-5p對MKN45細胞ERK1/2信號通路影響 Western blotting檢測結果顯示，NC組和miR-100-5p mimic組細胞中ERK1/2蛋白比較差異無統計學意義(P>0.05)；細胞中pERK1/2蛋白表達miR-100-5p mimic組低于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 miR-100-5p對MKN45細胞ERK1/2信號通路影響

3 討論

胃癌是一種侵襲性疾病，性質具有多樣性[1]。在過去的幾十年中，胃癌在全球范圍內發病率有所下降，但在我國人群中卻在上升，我國胃癌的發病率和病死率位居所有腫瘤第2位[9]。因此，尋求胃癌有效治療方法至關重要。手術切除是早期無遠處轉移或局部區域轉移胃癌患者最有效治療方法。然而，對于晚期胃癌患者，即使完全切除腫瘤并進行輔助化療，但由于轉移和化療耐藥導致預后也很差[2]。目前,幽門螺桿菌感染、高鹽攝入和吸煙被認為是胃癌發生和發展的主要危險因素[10]，但是胃癌的發生和發展相關分子機制現尚未完全明確。因此，闡明胃癌轉移和化療耐藥等腫瘤惡性進展的分子機制非常迫切。

miRNA是一類長度為17～25 nt的非編碼RNA，可通過靶基因與3' -UTR互補結合在轉錄后水平抑制mRNA，參與各種生理和病理過程。高度保守的miRNA在調節細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等腫瘤進程中發揮重要作用[4]。越來越多的研究表明，miRNA失調在胃癌的發生和發展中具有重要意義[11]。miR-100-5p是miRNA家族的重要成員，位于11q24.1號染色體上，具有高度保守性。有研究報道miR-100-5p高表達是口腔鱗狀細胞癌預后不良的分子標志物[12]。在腎細胞癌中miR-100-5p表達上調，并促進腫瘤細胞的增殖和轉移，抑制腫瘤細胞的凋亡[13]。然而，有學者報道miR-100-5p在肝細胞癌中表達下調與患者預后較差有關[6]。上述研究表明miR-100-5p具有腫瘤異質性，在不同腫瘤中具有不同功能。miR-100-5p在胃癌中的表達情況以往文獻未見報道，本文采用qRT-PCR檢測發現miR-100-5p相對表達量胃癌組織低于癌旁組織，胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45均低于人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1；并且miR-100-5p表達與胃癌細胞患者淋巴結轉移、TNM分期和化療效果相關。提示miR-100-5p表達與胃癌細胞增殖和轉移密切相關。本研究結果還顯示，MKN45細胞增殖能力及MKN45細胞穿膜細胞數miR-100-5p mimic組低于或少于NC組，差異有統計學意義。表明miR-100-5p在胃癌中發揮抑癌作用。

化療抵抗是腫瘤治療受阻的重要原因之一[3]。有研究報道miR-100-5p在腫瘤細胞化療耐藥過程發揮關鍵作用。miR-100-5p在非小細胞肺癌中促進腫瘤耐藥細胞對克唑替尼和洛拉替尼耐藥，為耐藥性的治療靶標[14]。然而，另一項研究表明，miR-100-5p可促進肺癌細胞對順鉑的敏感性[7]。奧沙利鉑是鉑類化合物中的一種，比順鉑具有更顯著的抗腫瘤作用，被廣泛應用于胃腸道腫瘤的治療，但對其耐藥性極大影響了患者預后[15]。本文對miR-100-5p是否在胃癌細胞對奧沙利鉑耐藥過程發揮重要作用進行了研究，結果顯示MKN45細胞對奧沙利鉑化療敏感性miR-100-5p mimic組較NC組增加，差異有統計學意義。說明過表達miR-100-5p的胃癌細胞對奧沙利鉑的敏感性增加。本研究發現miR-100-5p抑制胃癌細胞的增殖、轉移和化療耐藥，但是其具體作用機制仍需進一步探討。ERK1/2信號通路對包括胃癌在內的腫瘤細胞增殖、轉移和化療耐藥生物過程具有重要調控作用，pERK1/2促進腫瘤細胞增殖、轉移和化療耐藥[16]。本研究Western blotting檢測結果顯示，NC組和miR-100-5p mimic組細胞中ERK1/2蛋白比較差異無統計學意義；細胞中pERK1/2蛋白表達miR-100-5p mimic組低于NC組，差異有統計學意義。表明miR-100-5p可能通過下調ERK1/2信號通路抑制胃癌細胞增殖、轉移和對奧沙利鉑耐藥。

綜上所述，miR-100-5p在胃癌細胞中低表達，并與胃癌患者淋巴結轉移、TNM分期及化療效果相關。miR-100-5p可能通過調控ERK1/2信號通路抑制胃癌細胞增殖、轉移和對奧沙利鉑化療耐藥，是治療胃癌的潛在靶標。