基于網絡藥理學和分子對接探討二仙湯治療高血壓的作用機制

孟 園 李 平 劉 欣 袁 晶

1.北京中醫藥大學第三附屬醫院心內科，北京 100029；2.北京中醫藥大學，北京 100029

高血壓是臨床常見的心血管疾病，在全國乃至全球范圍內發病率和死亡率占較大比例，易合并腦血管意外、認知障礙、糖尿病等，極大地增加了社會負擔，同時其還是心血管疾病和其他疾病的主要死因。盡管目前高血壓的防治取得了一定進展，但仍任重而道遠。高血壓的發生除了與遺傳、飲食、情志等相關外，與性別亦有重要關系，其發病機制復雜，青年期男性發病率多高于女性，絕經前后女性發病率趕超同年齡男性[1]，且較男性血壓更不易控制[2]，因此高血壓的防治成為國內外研究的重點。中醫學無“高血壓”病名，一般將其歸于“眩暈”“頭痛”及“經斷前后諸證”范疇。二仙湯是名老中醫張伯訥教授的自創方，由淫羊藿、仙茅、黃柏、知母、巴戟天和當歸組成，具有溫腎益精、滋陰瀉火的作用，能調節性腺軸功能和激素水平，改善內分泌及心臟功能和血壓水平[3-6]。但作為中藥復方，二仙湯中的有效成分復雜、涉及的靶點和通路較多，難以闡明復方發揮作用的具體機制。因此，本研究應用網絡藥理學及分子對接的方法，探索二仙湯治療高血壓的作用機制，為其治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 二仙湯有效成分、靶點及疾病靶點的獲取

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索二仙湯中藥物，以生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為條件篩選，并獲得各成分對應的靶點。通過Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/）將靶點名轉化為標準基因名。以“Hypertension”為檢索詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（https://omim.org/）和Therapeutic target database 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）檢索高血壓靶點。

1.2 有效成分和交集靶點網絡及蛋白質-蛋白質相互作用網絡（proteinprotein interaction，PPI）的構建

對藥物靶點和疾病靶點取交集，運用Cytoscape軟件構建有效成分和交集靶點網絡圖。交集靶點上傳String 數據庫（https://string-db.org），PPI 評分設為0.7。通過Cytoscape 軟件實現網絡可視化，篩選度值大于所有節點度值中位數兩倍的節點為關鍵靶點[7]。

1.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析及“藥物-成分-靶點-通路”網絡構建

運用DAVID 6.7 數據庫（https://david-d.ncifcrf.gov/）對關鍵基因進行GO 和KEGG 富集分析，通過Cytoscape軟件建立“藥物-成分-靶點-通路”圖。

1.4 分子對接驗證

篩選出“藥物-成分-靶點-通路”中排名靠前的靶點和有效成分，并下載有效成分的3D 結構（mol2 格式），進行加氫、加電荷、檢測配體的root、可旋轉鍵的搜尋與定義等操作。下載靶蛋白的三維結構，并添加所有氫原子、計算Gasteiger 電荷、合并非極性氫。參數exhaustiveness 設為20，其他參數為默認值。采用Autodock vina 1.1.2 進行半柔性對接，并使用Pymol作圖。

2 結果

2.1 二仙湯有效成分、靶點及疾病靶點的篩選

通過TCMSP 獲得二仙湯的有效成分，其中淫羊藿23 個，仙茅7 個，巴戟天20 個，當歸2 個，知母15 個，黃柏37 個，總靶點共218 個。共得到高血壓靶點1073 個。

2.2 活性成分和交集靶點網絡及PPI 網絡的構建

共得到101 個交集靶點。二仙湯藥物-有效成分-交集靶點網絡中共有294 個節點，933 條邊。度值最高的有效成分分別是槲皮素、山柰酚和木犀草素。PPI網絡中共涉及101 個節點，739 個PPI 關系，見圖1。篩選出關鍵靶點共20 個，其中白細胞介素（interleukin，IL）-6 的度值最高，為48。

圖1 二仙湯的蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

2.3 GO 和KEGG 富集分析及“藥物-成分-靶點-通路”網絡

GO 富集分析共得到315 個條目（P ＜0.01），其中生物過程300 個，根據P 值從小到大排列選取前20 個，主要涉及細胞凋亡、對細菌和脂多糖的反應、促進細胞增殖與一氧化氮（nitric oxide，NO）合成等。細胞組成7 個，包括胞外區、膜封閉腔、核質及細胞器腔等。分子功能8 個，主要影響細胞因子、生長因子及蛋白激酶的活性、一氧化氮合酶調節劑的活性及等，見圖2。共得到信號通路25 條（P ＜0.01），根據P 值從小到大排列選取前20 個。見圖3。構建“藥物-成分-靶點-通路”圖，見圖4。其中矩形為藥物，六邊形為藥物成分（圓形為共有成分），V 形為通路，菱形為靶點。其中涉及57 個有效成分，101 個靶點，25 條通路。度值較高的成分有槲皮素、山柰酚和木犀草素等，靶點有前列腺素內過氧化物酶（prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS）2、PTGS1、絲裂原活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）1、Akt 激酶（Akt kinase，AKT）1 等。

圖2 GO 功能富集圖

圖4 藥物-成分-靶點-通路圖

2.4 分子對接驗證

根據“藥物-成分-靶點-通路”網絡篩選出度值最高的5 個有效成分和4 個靶蛋白。結果顯示，蛋白和有效成分對接的結合能均小于-5 kJ/mol（結合能小于-5 kJ/mol 提示配體和受體結合良好），提示靶蛋白和有效成分能穩固結合。其中PTGS2、PTGS1 分別與有效成分槲皮素、木犀草素結合最緊密，MAPK1 和AKT1 與脫水淫羊藿素結合最為密切。見圖5。

圖5 二仙湯的分子對接圖

3 討論

本研究結果提示，槲皮素、山柰酚及木犀草素等可能是二仙湯發揮作用的主要成分。研究表明，槲皮素有一定的降血壓作用[8]，其機制可能包括抗氧化、內皮依賴性及非內皮依賴性內皮功能改善等[9]，此外還能通過Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）4 降低心肌纖維化程度[10]。木犀草素能升高高血壓大鼠的NO水平，降低血管緊張肽（angiotensin，Ang）Ⅱ和內皮素-1濃度[11]，通過升高細胞內Ca2+濃度改善腎性高血壓[12]，并下調PI3K-Akt 通路、調節MAPK 通路和抑制活性氧生成以抑制血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖和遷移[13-14]。山柰酚能通過下調MAPK 通路逆轉內皮損傷及其炎癥反應[15]，增強內皮依賴性血管舒張功能[16]。PPI 網絡提示IL-6、AKT1及MAPK1 等在高血壓中發揮重要作用。有研究表明，IL-8、IL-6 和腫瘤壞死因子等炎癥因子可觸發正常人體中由Ang-Ⅱ引起的高血壓[17]。PTGS2 編碼的環氧合酶2 主要在炎癥因子、Ang-Ⅱ等因素刺激下誘導性表達，抑制其在造血細胞中的表達可促進鹽敏感性高血壓的發生[18]。

從富集分析來看，二仙湯主要通過細胞凋亡和增殖、對細菌的反應、NO 的合成等過程及Toll 樣受體通路、MAPK 通路、核苷酸結合寡聚結構域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）樣受體（NOD-like receptor，NLR）通路、促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）通路等調節血壓。TLR 在高血壓的慢性炎癥、氧化應激及血管重塑中充當重要角色[19]，其中Ang-Ⅱ誘導的高血壓與TLR3-β 干擾素TIR 結構域銜接蛋白通路的激活有關[20]。NLR 能與其他蛋白結合形成NLR 家族炎癥小體（NOD-like receptor protein，NLRP）。NLRP3 可激活高血壓中VSMC 增殖及表型轉化，敲除NLRP3 基因后上述表現明顯改善[21]。NO 能抑制GnRH 神經元放電以調節GnRH 的分泌和活性，而參與合成NO 的神經型一氧化氮合酶可能在雌激素負反饋抑制GnRH 水平中發揮了重要作用[22]。GnRH 作用于垂體前葉的G 蛋白偶聯受體，通過G 蛋白α 亞基家族介導MAPK 級聯的激活（包括p38MAPK及胞外信號調節激酶通路）[23]。研究表明，p38MAPK通路的激活能促進內皮型一氧化氮合酶磷酸化，增強NO 的信號轉導，并抑制活性氧的生成[24]。而阻斷胞外信號調節激酶信號傳導能抑制VSMC 增殖，進而改善血管重構[25]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學和分子對接技術探索了二仙湯治療高血壓的可能機制，即通過槲皮素、山柰酚與木犀草素等介導Toll 樣受體通路、MAPK通路、NOD 樣受體通路及GnRH 通路等發揮調節內皮功能、抗炎、抑制VSMC 增殖和遷移及抗氧化等作用，體現了中藥復方多成分、多靶點和多通路的特點，為其指導臨床應用提供理論依據，為后續二仙湯治療高血壓提供了理論基礎，但仍需進一步的研究和推廣。