miR-9-5p 通過靶向UBE4B 調節缺氧誘導轉錄因子1α 泛素化介導瓦博格效應在膠質瘤細胞中的應用

張晶晶 努爾艾合麥提江·牙力昆 杜 鵬

新疆醫科大學第二附屬醫院神經外科，新疆烏魯木齊 830063

與體細胞代謝比較，腫瘤細胞多采用有氧糖酵解的形式進行代謝，這種代謝表型稱為瓦博格效應[1-2]。在多種腫瘤中觀察到酵解酶[包括葡萄糖轉運蛋白同工型1（glucose transporter 1，GLUT1）、己糖激酶2（human hexokinase-2，HK2）和乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase，LDHA）]的表達活性升高[2]。缺氧誘導轉錄因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1α）是一種細胞適應氧應激的關鍵介質[3]。HIF1α 通過在其啟動子區域與HIF1α 反應元件（hypoxia response element，HRE）結合來增強糖酵解基因的表達[3]。HIF1α 的表達受到包括泛素化途徑在內的多種方式影響[4]。UBE4B作為一種重要的泛素化E3 連接酶已被證明可調節癌細胞的代謝重編程并促進腫瘤生長[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）通過與信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’-非翻譯區（3’untranslated region，3’-UTR）結合從而調控相關基因表達[6]。miR-9-5p 已顯示在包括乳腺癌、肺癌和胃癌的發展中起關鍵作用[7-9]。因此，本研究旨在探索miR-9-5p 在腫瘤發生中的作用，并深入探討UBE4B/HIF1α 在miR-9-5p 調控膠質瘤及瓦博格效應中的作用機制，為膠質瘤的治療思路提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本、細胞及動物

2018 年5 月至2020 年10 月收集30 例來自新疆醫科大學第二附屬醫院（以下簡稱“我院”）確診患者的神經膠質瘤及癌旁組織。研究設計得到我院醫學倫理委員會的批準。膠質瘤細胞（U251 細胞）購自中國科學院典型培養物保藏中心（中國上海）。將細胞置于含血清及雙抗的DMEM 培養基（美國Gibco，生產批號：0030034DJ）及5%的CO2和37°C 中培養。22 只5 周齡的雄性BALB/c 裸鼠購自上海實驗動物公司[許可證：SCXK（滬）2017-0006；質量合格證號：60304257]。

1.2 RNA 提取和實時定量PCR

根據制造商的說明，使用miRcute miRNA 試劑盒（中國天根，貨號：DP501）從組織或細胞中提取miRNA。使用miScript SYBR Green PCR Kit（天根，生產批號：FP411-02）測定miR-9-5p 的表達水平。使用Applied Biosystems 7300 實時PCR 系統進行定量實時PCR，內參基因分別為GAPDH 和U6。

1.3 蛋白質印跡

使用蛋白提取試劑盒提取蛋白質，然后使用BCA蛋白測定試劑盒（中國碧云天，貨號：P0012S）對樣品的蛋白質濃度進行標準化。封閉后，用抗UBE4B 抗體（美國Abcam，生產批號：ab126759），HIF1α（美國Abcam，生產批號：ab270520）和β-actin（美國Abcam，生產批號：ab6276），然后是辣根過氧化物酶結合的二抗（美國Abcam，生產批號：ab151752）。通過化學發光法進行檢測。

1.4 葡萄糖攝取分析

將U251 細胞用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，然后在含有葡萄糖的DMEM 中孵育3 h。用冰冷的PBS 洗滌細胞，并溶解在1%的SDS中。使用閃爍計數器（美國Beckman LS 6500，CA）確定每個等分試樣的放射性。重復6 次。

1.5 乳酸產量測量

按照制造商的說明方法，使用乳酸檢測試劑盒（中國碧云天，生產批號：P0012S）對U251 細胞乳酸的產生進行定量。使用CellTiter-Glo?發光細胞活力測定試劑盒（中國澤浩生物，貨號：G7570）測量ATP水平。重復6 次。

1.6 細胞活力和增殖分析

通過MTT 法來確定細胞活力。同時使用細胞增殖酶聯免疫吸附試驗（BrdU 試劑盒）（中國艾美杰，貨號：K306-200）來分析DNA 合成過程中生成的BrdU來檢測細胞增殖情況。重復6 次。

1.7 動物實驗

將穩定表達miR-9-5p 模擬物和對照組的5.0×106U251 細胞皮下注射到裸鼠前腿下方的皮膚上。在16 d 內觀察小鼠的腫瘤形成。然后處死小鼠，并確定每個腫瘤的濕重和體積。并按照“1.3”中方法對UBE4B、HIF1α 蛋白以及Glut1、HK2 和LDHA mRNA水平進行檢測。

1.8 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用t 檢驗。計數資料以例數或百分比表示。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-9-5p 對HIF1α 及糖酵解的影響

miR-9-5p 過表達組HIF1α 蛋白，Glut1、HK2、LDHA 和VEGF mRNA 表達顯著高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；而HIF1α mRNA 水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。miR-9-5p 抑制劑組HIF1α 蛋白，Glut1、HK2、LDHA 和VEGF 表達顯著低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；而HIF1α mRNA 水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表1 miR-9-5p 過表達對HIF1α 和糖酵解酶的表達的影響（）

表1 miR-9-5p 過表達對HIF1α 和糖酵解酶的表達的影響（）

注：HIF1α：缺氧誘導轉錄因子1α；Glut1：葡萄糖轉運蛋白同工型1；HK2：己糖激酶2；LDHA：乳酸脫氫酶A；VEGF：血管內皮生長因子

表2 抑制miR-9-5p 對HIF1α 和糖酵解酶的表達的影響（）

表2 抑制miR-9-5p 對HIF1α 和糖酵解酶的表達的影響（）

注：HIF1α：缺氧誘導轉錄因子1α；Glut1：葡萄糖轉運蛋白同工型1；HK2：己糖激酶2；LDHA：乳酸脫氫酶A；VEGF：血管內皮生長因子

2.2 miR-9-5p 調節神經膠質瘤細胞中的葡萄糖代謝

與對照組比較，miR-9-5p 過表達組顯著增強了代謝及轉移（P ＜0.05），而miR-9-5p 抑制劑組顯著降低了U251 細胞中的葡萄糖攝取和乳酸生成（P <0.05）。見圖1A～D。

圖1 miR-9-5p 調節神經膠質瘤細胞中的葡萄糖代謝（n=6）

2.3 miR-9-5p 在體外促進神經膠質瘤細胞增殖

增殖檢測顯示，miR-9-5p 過表達組在處理24 h和48 h 后的細胞活力顯著高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；而miR-9-5p 抑制劑組與對照組比較，細胞活力在24 h 和48 h 出現明顯下降，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2A～D。

圖2 miR-9-5p 促進神經膠質瘤細胞增殖（n=6）

2.4 miR-9-5p 促進體內腫瘤生長

體內實驗顯示，miR-9-5p 過表達組的腫瘤體積和濕重顯著高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3A～B。進一步分 析，miR-9-5p 過表達組 的UBE4B 的蛋白質水平低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3C。而HIF1α 及糖酵解相關基因（Glut1、HK2 和LDHA）的表達顯著高于對照組，差異有統計學差異（P ＜0.05）。見圖3D～E。

圖3 miR-9-5p 促進體內腫瘤生長

2.5 膠質瘤組織中miR-9-5p 與糖酵解因子相關性

相關性分析顯示，miR-9-5p 的表達與Glut1（R2=0.4734，P=0.032）、HK2（R2=0.5837，P=0.004）和LDHA（R2=0.6217，P=0.016）水平呈正相關。

3 討論

膠質瘤是腦中常見的腫瘤之一，占惡性腦腫瘤的80%[10]。患者經常會出現嘔吐、頭痛、感覺障礙和反復發作，從而導致生活質量下降。盡管已經采用了影像學、手術、放射療法等新興方法進行治療，但仍無法治愈[11-14]。因此，深入了解膠質瘤的機制對其預防、診斷和治療具有重要意義。

已有研究顯示，miRNA 的失調可以改變包括膠質瘤在內的腫瘤細胞中關鍵糖酵解酶的表達和活性[15-19]。例如，miR-495 通過直接抑制Glut1 介導神經膠質瘤細胞的新陳代謝[20]。本研究同樣發現，miR-9-5p能夠影響瓦博格效應[21]，進一步探討發現其與HIF1α的表達存在同向性且對其mRNA 的表達影響較弱，提示轉錄后調控可能是miR-9-5p 的主要調控途徑。通過對miR-9-5p 靶基因的預測與HIF1α 互作蛋白的分析，篩選出UBE4B 調控的HIF1α 泛素化可能是其中的重要作用途徑，這些觀點在本研究中得到了有效證明。目前已有多項報道證實泛素化調控在瓦博格效應中的作用[22-25]，本研究創新性地對miR-9-5p在其上游的影響進行了驗證，這對未來的靶向治療提供了重要的參考依據。

綜上所述，miR-9-5p 可以通過UBE4B/HIF1α調節神經膠質瘤的瓦博格效應，這些結果可能為癌癥治療提供新的靶向研究方向。