鞣花酸磷脂復合物的制備及其口服生物利用度研究

張留超，劉勇華

（黃河科技學院，河南 鄭州 450005）

文獻［5?7］ 報道，藥物與磷脂形成磷脂復合物后其水溶性、脂溶性均可得到提高，有助于促進藥物口服吸收；蔣新龍等［8］采用質子溶劑乙醇作為反應溶劑制備了鞣花酸磷脂復合物，但其復合率不足92%，可能與溶劑選擇不當、工藝考察不精確有關。本實驗以非質子溶劑四氫呋喃為反應溶劑［9］制備鞣花酸磷脂復合物，并考察其口服生物利用度，以期為相關制劑研究提供參考。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；SH23?1 型磁力攪拌器（上海江星儀器有限公司）；AR1140 型電子天平［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；DZF?6050 型真空干燥箱（上海欣齊科學儀器有限公司）；XPert Powder 型X 射線衍射儀（英國馬爾文公司）；RE?3000 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

鞣花酸原料藥（純度98.0%，批號190320，武漢荊楚陳氏醫藥化工有限公司）；鞣花酸對照品（純度99.6%，批號110726?201707，中國食品藥品檢定研究院）；大豆卵磷脂（批號PC98T，磷脂酰膽堿質量分數＞98%，上海輔必成醫藥科技有限公司）。清潔級SD 大鼠，體質量180～220 g，購自河南省實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK（豫）2016?0012。

2 方法與結果

2.1 鞣花酸磷脂復合物制備 取50 mg 原料藥（45 ℃下真空干燥1 d）、處方量磷脂，置于三角瓶中，加入四氫呋喃制得混懸液，立即密封，置于一定溫度水浴中，磁力攪拌適當時間后得澄清溶液，真空旋蒸除去有機溶劑，即得（性狀為淺黃色半固體）。

2.2 鞣花酸含量測定

2.2.1 色譜條件 Waters Extend?C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長254 nm；流動相甲醇?水（含0.1%磷酸）（45 ∶55）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

2.2.2 線性關系考察 精密稱取鞣花酸對照品10.0 mg，溶于1.0 mL 四氫呋喃中，甲醇定容至10 mL，得1.0 mg／mL 母液，精密吸取1.0 mL 至100 mL量瓶中，流動相定容至刻度，得到10.0 μg／mL對照品溶液，“2.2.1”項下流動相稀釋至10.0、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg／mL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積（Y）對鞣花酸質量濃度（X）進行回歸，得方程為Y＝14.314 2X＋0.648 9（r＝0.999 8），在0.05～10.0 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 取鞣花酸磷脂復合物約10 mg，置于100 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，取2.5 mL 至10 mL 量瓶中，“2.2.1”項下流動相定容至刻度，即得。

1.2 標本采集 抽取孕婦空腹外周靜脈血5 ml裝入真空普管中。待自凝后取血清3 000 r/min低溫離心5 min，吸取上清液，置于-22°冰箱保存待同批測量。

2.2.4 方法學考察 取鞣花酸磷脂復合物適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得鞣花酸峰面積RSD 為1.20%，表明該方法重復性良好。取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得鞣花酸峰面積RSD 為0.58%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。取“2.2.2”項下0.5、2.5、10.0 μg／mL對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得鞣花酸峰面積RSD 分別為0.62%、0.43%、0.16%，表明儀器精密度良好。稱取9 份鞣花酸磷脂復合物，加入“2.2.2”項下1.0 mg／mL對照品溶液1.25、2.50、3.75 mL，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，測得鞣花酸平均加樣回收率分別為98.96%、100.68%、99.17%，RSD 分別為1.11%、0.84%、1.50%。

2.3 復合率測定 精密稱取一定量鞣花酸（X0）制備磷脂復合物，加入10 mL 乙醚，振蕩溶解后過0.22 μm 微孔濾膜，濾液減壓旋蒸除去乙醚，收集固體至100 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，取2.5 mL至10 mL 量瓶中，“2.2.1”項下流動相定容，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定參加復合的鞣花酸質量（X1），計算復合率，公式為復合率＝（X1／X0）×100%。

2.4 Box?Behnken 響應面法 固定鞣花酸用量不變，課題組前期發現磷脂用量（A）、制備溫度（B）、制備時間（C）是影響復合率的主要影響因素，三者水平見表1。再選擇復合率（Y）作為評價指標，采用Box?Behnken 響應面法優化制備工藝，結果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

對表2 數據進行擬合，得到二次多元回歸方程為Y＝93.16 ＋6.89A＋3.90B＋5.51C－ 2.58AB－1.40AC－5.47BC－4.33A2－0.55B2－2.33C2（R2＝0.983 3，P＜0.000 1，F＝0.082 5，＝0.961 9），R2較接近，表明擬合度良好；F＞0.05，表明未知影響因素對實驗結果干擾很小，模型可信度較高，方差分析見表3。由此可知，各因素對復合率均有顯著影響（P＜0.01），以A更明顯，可能是由于磷脂用量不足會嚴重影響復合率所致，并且交互項AB、BC也有顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

通過Design Expert V8.0.6 軟件進行分析，結果見圖1。由圖1a～1b 可知，固定某一因素時復合率隨均隨著另外2 個因素同時增加而增大，而后有所下降；由圖1c 可知，雖然隨著制備溫度、制備時間增加復合率逐漸增大，但達到一定程度時反而明顯下降，可能是過高的制備溫度、過長的制備時間會對磷脂或其復合物穩定性產生一定影響，從而影響復合率。

圖1 各因素響應面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

設置復合率最大值為100%，最小值為0，得到最優制備工藝為磷脂用量141.6 mg（鞣花酸與磷脂比例約為1 ∶1.1），制備溫度46.9 ℃，制備時間4.7 h，復合率為99.0%。按上述優化工藝制備3 份鞣花酸磷脂復合物，測得復合率分別為99.4%、99.7%、98.9%，平均99.3%，與預測值99.0%接近（相對誤差為0.3%），表明模型預測性、重復性良好。

2.5 存在狀態分析 XRPD 掃描條件為Cu?Kα 靶，掃描范圍（2θ）4°～40°，電 流40 mA，速 度8°／min。取約10 mg 待測物，玻璃片壓平后固定于X 射線粉末衍射儀上測定，結果見圖2。由此可知，原料藥在9.3°、10.1°、12.1°、28.4°等處出現特征晶型峰；在物理混合物（比例同磷脂復合物）中，磷脂、鞣花酸強度均發生較大幅度的下降，前者晶型衍射峰基本消失，但仍可發現后者在12.1°、28.4°處的特征晶型峰；磷脂復合物中鞣花酸所有晶型衍射峰均消失，表明它是不同于物理混合物的一種物質，鞣花酸在其中以無定型狀態存在。

圖2 樣品XRPD 圖Fig.2 XRPD patterns for samples

2.6 溶解度測定 取過量鞣花酸、物理混合物、磷脂復合物至三角瓶中，加入蒸餾水或正辛醇，25 ℃下磁力攪拌48 h，分別取3 mL 至離心管中，6 000 r／min 離心5 min，取上清液，測定表觀溶解度，結果見表4，可知鞣花酸制成磷脂復合物后在水、正辛醇中的表觀溶解度分別提高至3.22、7.18 倍。另外，該成分在物理混合物中的溶解度也有所提高，可能是由于磷脂增溶作用所致。

表4 樣品表觀溶解度測定結果（， n＝6）Tab.4 Results of apparent solubility determination of samples（， n＝6）

表4 樣品表觀溶解度測定結果（， n＝6）Tab.4 Results of apparent solubility determination of samples（， n＝6）

注：與鞣花酸比較，**P＜0.01；與物理混合物比較，＃＃P＜0.01。

2.7 口服生物利用度研究

2.7.1 分組、給藥與采血 取原料藥、物理混合物、磷脂復合物適量，加入0.5% CMC?Na 溶液，超聲30 s 后得混懸液（鞣花酸質量濃度均為15 mg／mL）。取過夜禁食的18 只大鼠，隨機分為原料藥組、物理混合物組、磷脂復合物組，每組6只，灌胃給藥，劑量100 mg／kg，灌胃后立即計時，于0.15、0.25、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 將大鼠置于盛有乙醚的容器中麻醉10 s后，立即用浸潤有肝素抗凝劑的玻璃毛細管眼眶采血各約0.2 mL，引流至涂有肝素抗凝的離心管中，3 000 r／min 離心2 min，血漿保存于－10 ℃冰箱中。

2.7.2 血漿樣品處理 參考文獻［3，10］ 報道的方法，取100 μL 血漿樣品，加入150 μL 1 mol／L KH2PO4、20 μL 50%磷酸，渦旋混合5 min，加入1 mL 乙腈渦旋混合5 min，7 500 r／min 離心5 min，轉移上清液，再加入0.5 mL 乙腈洗滌，合并2 次上清液，N2緩慢吹干，于殘渣中加入100 μL 甲醇，超聲10 s，7 500 r／min 離心5 min。

2.7.3 線性關系考察 取鞣花酸對照品適量，甲醇制成1 000、500、250、100、50、25 ng／mL 對照品溶液，分別取100 μL 至離心管中，氮氣緩慢吹干得殘渣，加入100 μL 空白血漿，渦旋5 min，即得1 000、500、250、100、50、25 ng／mL 血漿對照品溶液，按“2.7.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），鞣花酸質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程Y＝0.012 5X＋0.055 3（r＝0.993 8），在25～1 000 ng／mL 范圍內線性關系良好。

2.7.4 方法學考察 取空白血漿、含藥血漿（磷脂復合物給藥12 h）、空白血漿＋25 ng／mL 血漿對照品溶液，按“2.7.2”項下方 法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖3，可知鞣花酸出峰時間為9.6 min，血漿內源性物質不干擾測定，專屬性強。室溫下于0、4、8、12、24、48 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得鞣花酸峰面積RSD 為6.39%，表明樣品在48 h 內穩定性良好。取“2.7.3”項 下25、250、1 000 ng／mL血漿對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得鞣花酸峰面積分別為3.14%、4.04%、1.68%，表明儀器精密度良好。取鞣花酸對照品適量，按“2.7.3”項下方法制備25、250、1 000 ng／mL 血漿對照品溶液，按“2.7.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得平均加樣回收率分別為90.43%、87.69%、92.05%，RSD 分別為4.07%、3.22%、2.48%。將“2.7.3”項下25 ng／mL 血漿對照品溶液逐步稀釋，測得定量限（S／N＝10）為5.0 ng／mL，檢測限（S／N＝3）為2.0 ng／mL。

圖3 鞣花酸HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of ellagic acid

2.7.5 藥動學研究 圖4、表5 顯示，與原料藥、物理混合物比較，磷脂復合物tmax縮短（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度提高至2.46 倍。

表5 鞣花酸主要藥動學參數（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for ellagic acid（， n＝6）

表5 鞣花酸主要藥動學參數（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for ellagic acid（， n＝6）

注：與原料藥比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與物理混合物比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖4 鞣花酸血藥濃度?時間曲線Fig.4 Plasma concentration?time curves for ellagic acid

3 討論

本實驗選擇非質子溶劑（四氫呋喃）制備鞣花酸磷脂復合物，其復合率高于質子溶劑（如乙醇等）制備者，可能是質子溶劑會對藥物和磷脂形成復合物時產生一定干擾作用，從而影響了復合率。所得最優制備工藝的復合率接近100%，而且鞣花酸在水、正辛醇中的溶解度分別提高至3.22、7.18 倍，遠高于乙醇制備者（1.4、2.1 倍）［8］，具體原因有待進一步研究。

在血漿樣品處理過程中，藥物損失會影響含量測定的準確性，一般采用內標法。但對于鞣花酸血漿樣品而言，在酸性條件下采用外標法［3，10?12］處理時，血漿內源性物質不干擾測定，回收率均大于87.69%，而且操作簡單，故本實驗也選擇該方法，與Mady 等［3］報道基本一致，可能是由于在酸性環境中更有利于鞣花酸進入乙腈而被有效提取出。

藥動學結果顯示，磷脂復合物可將鞣花酸口服吸收生物利用度提高至2.50 倍，可能與該劑型改變了后者存在狀態、提高了其水溶性和脂溶性有關，但該成分易被胃腸道酶解［11］。文獻［13］ 報道，磷脂復合物提高藥物生物利用度還與灌胃液配制方式有關，并且其程度也可能存在差異。本實驗所制備的鞣花酸磷脂復合物脂溶性得到極大改善，可為后續相關納米制劑的開發奠定基礎［14?17］。