一測多評法同時測定舒血寧注射液中4 種銀杏內酯

游蓉麗，林 珊，楊曉寧，高治華，姚 靜

（1.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京100700； 2.上海醫藥工業研究院，上海200433；3.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京100085； 4.山西振東泰盛制藥股份有限公司，山西 大同 037010）

舒血寧注射液是由銀杏葉提取物制成的中藥注射劑，臨床上主要用于治療缺血性心腦血管疾病、冠心病、心絞痛等，具有較好的療效［1?3］，其主要活性成分為銀杏內酯、黃酮［4?6］，前期大多采用HPLC?ELSD 法測定銀杏內酯A、B、C 和白果內酯含量［7］，但流動相采用非常規、復雜的正丙醇?甲醇?四氫呋喃?水系統，而且樣品前處理時需進行乙酸乙酯萃取、復溶等操作［8］，增加了準確定量難度和分析工作量。本實驗采用常規的甲醇?水流動相系統，并在簡化樣品前處理方法的基礎上，以更易得、廉價的銀杏內酯A 為內標，計算它與銀杏內酯B、銀杏內酯C、白果內酯的相對校正因子，建立一測多評法同時測定舒血寧注射劑中上述4 種成分的含量［9?10］，以期為該制劑質量評價提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜系統（配置四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、VWD 檢測器）、Agilent 385?ELSD 蒸發光散射檢測器（美國Agilent Technologies公司）；MSA365?OCE?OH 電子分析天平（德國Sartorios 公司）；Milli?Q Advantange A10 純水機（美 國Millipore 公司）；KQ?250DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 銀杏內酯A（純度97.4%，批號110862?201602）、銀杏內酯B（純度95.6%，批號110863?201611）、白果內酯（純度99.8%，批號110865?201507）、銀杏內酯C（純度94.0%，批號110864?201809）對照品均購于中國食品藥品檢定 研究院。舒血寧 注射液（批 號 1905262、1905271、1905272、1905281、1905282、1906181、1906182、1906191、1906192）由振東泰盛藥業有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純［阿達瑪斯試劑（上海）有限公司］。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C 對照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含四者0.09、0.25、0.13、0.19 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取舒血寧注射液適量，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件TSK gel ODS?100V 色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相水（A）?甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，90%～75%A，10%～25%B；10～50 min，75%～65% A，25%～35% B；50～55 min，65%～40%A，35%～60%B）；體積流量0.6 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；ELSD檢測器漂移管溫度90 ℃；氮氣（N2）體積流量1.5 L／min。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 文獻［4?5］ 報道，舒血寧注射液主要成分為銀杏內酯、黃酮醇苷。圖1 顯示，樣品中該成分色譜峰分離較好，相同條件下空白溶劑無干擾峰，表明該方法專屬性良好。

圖1 各銀杏內酯HPLC?ELSD 色譜圖Fig.1 HPLC?ELSD chromatograms of various ginkgolides

2.3.2 線性關系考察 制備6 個質量濃度對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以各成分進樣量的常用對數為橫坐標（X），峰面積的常用對數為縱坐標（Y）進行回歸，并分別以信噪比（S／N）10 ∶1、3 ∶1 為定量限、檢測限，結果見表1，可知各銀杏內酯在各自范圍內線性關系良好。

表1 各銀杏內酯線性關系Tab.1 Linear relationships of various ginkgolides

2.3.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液20 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定6 次，計算日內精密度；另精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.2”項色譜條件下連續進樣測定3 d，每天2 次，計算日間精密度，測得白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C 峰面積RSD 分別為2.82%、2.16%、2.04%、3.26%，表明該方法精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取注射液（批號1905262）6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣20 μL 測定，測得白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C 含量RSD 分別為1.99%，2.15%，1.85%，2.96%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取注射液（批號1905262）1份，于0、3、6、9、12、24 h 在“2.2”項色譜條件下進樣20 μL 測定，測得白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C 峰面積RSD 分別為3.09%、3.19%、2.30%、3.82%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密量取5.0 mL 注射液（批號1905262）至10 mL 量瓶中，平行9 份，其中3 份加入對照品溶液0.5 mL，甲醇定容，作為低質量濃度組供試品溶液；3 份加入對照品溶液1.0 mL，甲醇定容，作為中質量濃度組供試品溶液；3 份加入對照品溶液1.5 mL，甲醇定容，作為高質量濃度組供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下各進樣20 μL 測定，計算回收率，結果見表2。

2.4 相對校正因子測定 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液4、8、10、15、20、25 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，以銀杏內酯A 為內標，計算其他3 種成分的相對校正因子fs／k，公式為fs／k＝（Ms×lgAk）／（Mk×lgAs），其中Ms為內標質量，Mk為其他成分質量，lgAs為內標峰面積對數，lgAk為其他成分峰面積對數，結果見表3。

表3 各成分相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.5 色譜峰定位 分別在不同柱溫、體積流量、色譜儀下測定相對保留時間，結果見表4～6，可知RSD 或相對誤差均＜2%，表明以相對保留時間定位色譜峰合理可行。

表4 不同柱溫下相對保留時間Tab.4 Relative retention time under different column temperatures

表5 不同體積流量下相對保留時間Tab.5 Relative retention time under different volumetric flow rates

表6 不同色譜儀下相對保留時間Tab.6 Relative retention time under different chromatographic instruments

2.6 耐用性考察 取同一份注射液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，并分別在不同柱溫、體積流量、色譜儀下對相對校正因子進行考察，結果見表7～9，可知RSD或相對誤差均＜2.0%，表明該方法重復性良好。

表7 不同柱溫下相對校正因子Tab.7 Relative correction factors under different column temperatures

表8 不同體積流量下相對校正因子Tab.8 Relative correction factor under different volumetric flow rates

表9 不同色譜儀下相對校正因子Tab.9 Relative correction factors under different chromatographic instruments

2.7 樣品含量測定 取9 批舒血寧注射液，分別采用外標法、一測多評法測定4 種銀杏內酯含量，再通過SPSS 14.0 軟件對結果進行t檢驗，結果見表10，可知均無顯著差異［相對平均偏差（RAD）＜2%］，表明一測多評法穩定可行。

表10 各銀杏內酯含量測定結果（n＝9）Tab.10 Results of content determination of various ginkgolides（n＝9）

3 討論

3.1 流動相確定 2020 年版《中國藥典》 一部含量測定項［11］及文獻［12?13］ 報道中檢測銀杏內酯時，均采用四氫呋喃，但其毒性較大。本實驗比較了甲醇?水、甲醇?乙腈?水體系下目標化合物的分離效果，發現前者洗脫時4 種成分色譜峰的峰形、分離度良好，基線平穩，而且更簡便環保。

3.2 樣品處理方法確定 為了更準確地反映舒血寧注射液中萜類、內酯類成分的真實含量，本實驗采用注射液直接進樣的方法進行檢測，發現4 種成分的分離效果良好，雜質無干擾。相對于文獻［8，12?14］ 采用乙酸乙酯萃取、蒸干、復溶等前處理方法，本實驗可大大減輕分析人員的工作量，并提高含量測定的準確性。

3.3 一測多評法考察 銀杏內酯A 是舒血寧注射液主要特征成分之一，含量較高，而且其對照品容易獲得，質量穩定，價格低廉，故本實驗選擇其作為內標［14］。再考察了在不同色譜儀、柱溫、體積流量下白果內酯、銀杏內酯B、銀杏內酯C 的相對保留時間及相對校正因子，發現其重復性均較好。最后，將一測多評法所得結果與外標法進行比較，發現無明顯差異，表明該方法可用于舒血寧注射液中4 種銀杏內酯含量的測定。