UPLC?MS／MS法同時測定女金膠囊中10種成分

梁 艷，張 峰

（1.河南應用技術職業學院，河南 鄭州450040； 2.開封市食品藥品檢驗所，河南 開封 475001）

女金膠囊是由當歸、白芍、川芎等23 味藥材組成的復方制劑，具有益氣養血、理氣活血、止痛的功效［1］，方中藥材主要成分阿魏酸、芍藥苷、桂皮醛、橙皮苷有抗炎、抗氧化等作用［2］，毛蕊花糖苷有抗血栓、抗腫瘤等作用［3］，歐前胡素、延胡索乙素有鎮痛作用［4］，其活性均與女金膠囊臨床作用密不可分。前期報道采用HPLC 法測定女金膠囊中芍藥苷、橙皮苷、黃芩苷、丹皮酚含量［5?7］，但尚未涉及其君藥當歸、川芎中的主要成分阿魏酸。另外，歐前胡素、延胡索乙素、毛蕊花糖苷由于含量太低，無法采用傳統HPLC 法及紫外檢測器進行定量。

UPLC?MS／MS 法與HPLC 法相比，具有專屬性強、分析時間短、靈敏度高的優勢，而且通過不同化合物的特征母離子與其子離子的對應關系可解決復雜樣品準確定性定量問題。因此，本實驗首次建立UPLC?MS／MS 法同時測定女金膠囊中益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素的含量，以期為該制劑質量評價提供參考。

1 材料

ACQUITY UPLC H?Class Plus Xevo TQ?S Micro三重四級桿液質聯用儀（美國Waters 公司），配置Mass Lynx 數據處理系統、ESI 離子源；New Classic電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler?Toledo 公司）；KQ?250ES 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JH?A 超純水機（江輝環保科技有限公 司）。女金膠囊（批號 200712、200816、200912）購自藥店。阿魏酸（110773?201614，純度99.0%）、毛蕊花糖苷（111530?201914，純度95.2%）、芍藥苷（110736?201035，純度96.5%）、鹽酸益母草堿（11823?201704，純度94.3%）、甘草酸銨（110731?202021，純度96.2%）、橙皮苷（110721?201617，純度96.1%）、歐前胡素（110826?201415，純度99.7%）、延胡索乙素（110726?201819，純度99.8%）、桂皮醛（110710?201821，純度99.6%）、黃芩苷（110715?201016，純度93.3%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、甲酸、乙腈為色譜純（美國Fisher Scientific 公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜Phenomenex Kinetex C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%B；0.5～2 min，90%～70%B；2～8 min，70%～20%B；8～8.2 min，20%～90%B；8.2～10 min，10%B）；體積流量0.40 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

2.1.2 質譜 ESI 離子源；MRM 模式，正負離子切換掃描；毛細管電壓3.1 kV；錐孔電壓40 V；源區溫度148 ℃；干燥氣溫度480 ℃，體積流量950 L／h；霧化器壓力250 kPa；霧化氣N2；碰撞氣Ar。其他質譜參數見表1。

表1 各成分質譜參數Tab.1 MS parameters for various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、桂皮醛、甘草酸銨、歐前胡素、橙皮苷、黃芩苷對照品適量，用溶劑A（量取50%乙腈2 L，加入2.0 mL甲酸，混合均勻）超聲溶解稀釋，作為對照品溶液①，各成分質量濃度分別為0.051 10、0.810 4、0.050 55、0.010 02、0.020 28、1.521、1.533、0.406 4、0.404 4、0.203 4 g／L。精密量取5 mL，置于20 mL 量瓶中，溶劑A 稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液②。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊20 粒，傾去內容物，混勻，取約0.2 g，精密稱定，置于250 mL 燒瓶中，加入70%乙醇約100 mL，80 ℃水浴加熱回流提取70 min，放冷，濾過，濾液過濾至250 mL 量瓶中，50 mL 70% 乙醇洗滌殘渣，再加入甲酸約0.25 mL 至量瓶中，70%乙醇稀釋至刻度，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 參照文獻［1］ 報道的處方，取除當歸、白芍、川芎、熟地黃、甘草、肉桂、益母草、牡丹皮、醋延胡索、白芷、黃芩、陳皮以外的其他13 味藥材，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分的分離度和峰形良好，陰性無干擾。

圖1 各成分MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液②，用溶劑A 按適當比例稀釋成系列質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），各對照品質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，并分別以S／N ＝10、S／N ＝3 為定量限、檢測限，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液②，在“2.1”項色譜條件下進樣測定7 次，測得益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素峰面積RSD 分別為2.73%、2.52%、2.30%、3.51%、2.90%、2.84%、2.42%、2.72%、2.03%、3.81%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取膠囊（批號200712）6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素峰面積RSD 分別為 2.32%、2.45%、3.33%、3.65%、2.93%、2.62%、2.11%、2.57%、2.20%、3.01%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取“2.3.4”項下供試品溶液，于0、2、4、8、12、20、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素峰面積RSD 分別為2.55%、2.12%、2.88%、3.58%、2.93%、2.62%、3.36%、2.57%、2.67%、3.01%，表 明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的膠囊9 份，每份約0.1 g，置于250 mL 燒瓶中，精密量取“2.2.1”項下對照品溶液②0.5、1、1.5 mL，每個質量濃度3 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素平均加樣回收率分別為98.80%、96.61%、98.05%、97.32%、99.34%、98.95%、97.83%、97.55%、99.43%、99.94%，RSD 分別為2.30%、1.76%、2.29%、2.74%、2.30%、2.28%、2.55%、2.73%、2.30%、2.44%。

2.3.7 樣品含量測定 取3 批膠囊（編號S1～S3），每批2 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果（mg／g， n＝2）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝2）

3 討論與結論

查閱文獻［8?10］，本實驗曾采用70%乙醇超聲提取，但發現桂皮醛、歐前胡素提取效率不高，故選擇回流提取。再考察了提取溶劑50% 乙醇、70%乙醇、乙醇，80 ℃水浴加熱回流30、45、60、75 min，發現用70% 乙醇提取時效率最高，提取60 min后各成分含量不再增加；提取75 min 時，芍藥苷、桂皮醛、歐前胡素含量稍有下降。最終確定，提取方法為80 ℃水浴中用70%乙醇加熱回流60 min。

本實驗比較了甲醇?水、乙腈?水、甲酸?水等洗脫系統［11?16］，發現以0.1%甲酸?乙腈為流動相時各成分峰形、分離度均符合要求，同時考慮到溶劑效應的存在，采用流動相來稀釋樣品。由于毛蕊花糖苷含量較低，為保證其靈敏度，對其保留時間±0.5 min范圍內的駐留時間進行手動分配和分段掃描，同時為了防止保留時間接近的待測組分互相干擾，又采用了正負離子切換掃描方式，采集模式選擇MRM，可保證方法專屬性。

綜上所述，本實驗首次采用UPLC?MS／MS 法同時測定女金膠囊中的10 種成分，發現該方法具備專屬性強、速度快、靈敏度高、節省溶劑的特點，可為提高該制劑的質量標準提供參考。