云南松松塔對LPS 誘導急性肺損傷大鼠炎癥和氧化應激的影響

鄧 多，譚會玲，上官云蘭，吳道勛，耿 玲，劉光明，陳俊雅*

（1.大理大學藥學院，云南 大理671000； 2.滇西應用技術大學，云南 大理671006； 3.大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺炎、敗血癥、呼吸道細菌或病毒感染等多種因素引起的危重癥常見的嚴重肺部并發癥［1］，其特征主要是中性粒細胞內流，肺泡毛細血管屏障損傷導致間質性水腫，呼吸功能受損［2］，嚴重者會導致多器官功能衰竭而死亡。目前，由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS?CoV?2）引發的2019 新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）依然在全球蔓延，造成許多患者出現嚴重肺炎和急性肺損傷，在COVID?19 中嚴重呼吸系統疾病可發展為急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙綜合征［3］。雖然目前有關ALI 病理生理學方面的研究已有了很大進展，但尚無特效藥物，仍然是危重病人發病和死亡的主要原因。

研究表明，松科松屬植物云南松Pinus yunnanensisFranch.的球果松塔乙醇提取物具有抗腫瘤［4?5］、抗氧化［6］等多種藥理活性，能明顯抑制肺纖維化動物模型炎癥因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF?α）、白介素1β（interleukin 1β，IL?1β）、白介素6（interleukin 6，IL?6）和干擾素γ（interferon gamma，IFN?γ）釋放，但未見其對急性肺損傷的深入研究。因此，本實驗在前期建立云南松松塔對肺纖維化動物模型的基礎上，通過考察云南松松塔對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI 大鼠的影響，進一步明確該藥材對肺部疾病的治療作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級SD 大鼠，雌雄各半，體質量180～200 g，購自湖南斯萊克景達有限公司，動物生產許可證號SCXK（湘）2016?0004，給藥前適應性喂養1 周，自由飲水進食。

1.2 試劑與藥物 云南松松塔采自云南省大理州大理市下關鎮蒼山東坡，經大理大學藥學院劉光明教授鑒定為云南松Pinus yunnanensisFranch.的松果，即松塔，自然晾干后粉碎，95% 乙醇浸泡3 次，1%氫氧化鈉提取，濾過，濾液分別用1、2、5倍量95%乙醇沉淀，合并沉淀物，減壓干燥，得到云南松松塔提取物。脂多糖（LPS）（批號042619190814，上海碧云天生物技術有限公司）；醋酸地塞米松片（批號170108，浙江仙琚制藥股份有限公司）。酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（大鼠IL?6，批號20 190524；大鼠TNF?α，批號20 190902；大鼠TGF?β1，批 號20 190902；大 鼠IL?10，批 號20 190902；大鼠IL?1β，批號20190920）均購自深圳索萊寶科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）測試盒（批號20190820）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（批 號20190829）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號20190827）、過氧化氫酶（catalase，CAT）測試盒（批號20190829）均購自南京建成生物工程研究所；TrizolTMRegent、cDNA 第一鏈合成試劑盒、Power UpTMGreen Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RT?PCR 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；酶標儀（美國Gene 公司）；8 道分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；核酸蛋白測定儀（美國Thermo fisher 科技公司）；PCR 儀（德國Biometra 公司）；電泳系統（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 分組與給藥 將大鼠隨機分為空白組，模型組，陽性組及云南松松塔提取物低、中、高劑量組，每組8 只，陽性組灌胃給予1.5 mg／kg 地塞米松，云南松松塔低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予50、100、200 mg／kg 相應提取物，空白組、模型組大鼠灌胃給予等容量生理鹽水，連續4 d。第4 天給藥后1 h 除空白組外，其余各組大鼠均腹腔注射LPS（10 mg／kg）誘導急性肺損傷［7］，4 h 后處死，收集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、肺臟，計算臟器指數，公式為臟器指數＝臟器質量／體質量。

2.2 支氣管肺泡灌洗液制備 實驗結束后處死大鼠，打開胸腔，左肺上葉結扎，摘取支氣管，用5 mL生理鹽水沖洗，收集沖洗液，3 000 r／min 離心10 min，收集上清，在－80 ℃下保存，即為支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。

2.3 組織學評價 剪取結扎大鼠左肺，固定于4%多聚甲醛溶液中，脫水后石蠟包埋，5 μm 切片，蘇木素?伊紅（hematoxylin?eosin，HE）染色，觀察肺泡壁及支氣管壁厚度、炎性細胞浸潤情況、充血水腫情況。

2.4 BALF 中氧化因子水平檢測 取大鼠BALF，按照試劑盒說明書檢測SOD、MDA、NO、CAT 水平。

2.5 BALF 中炎癥因子水平檢測 取上清、不同質量濃度對照品及其稀釋液各100 μL，加入預包被單克隆抗體的96 孔板中，洗板，加入100 μL 生物素化抗體孵育1 h，洗板，加入辣根過氧化物酶并避光孵育30 min，洗板，加入100 μL 酶結合物抗體，孵育15 min 后加入終止液，用酶標儀在450 nm波長處測量3 次。采用酶聯免疫吸附試劑盒，檢 測BALF 中TNF?α、IL?6、IL?1β、IL?10、TGF?β1 水平。

2.6 TLR4／NF?κB 信號通路因子的mRNA 相對表達檢測 取20 mg 大鼠肺組織，按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，利用NanoDrop One spectrophotometer、1%瓊脂糖凝膠精確測定RNA 濃度和確定完整性，當A260／A280在1.8～2.0 范圍內時，可用于后續的cDNA 分析。取500 ng 總RNA，按照試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，Toll 樣因子4（TLR4）、核因子κB（NF?κB）、IL?1β、IL?6、TNF?α的相對基因表達通過PCR 進行評價。通過逆轉錄反應獲得的cDNA 稀釋8 倍，并進行RT?PCR 分析，條件設定為95 ℃變性30 s，95 ℃變性10 s，40 個循環，60 ℃變性30 s，最后運行溶解曲線。以 GAPDH（glyceraldehyde 3?phosphate dehydrogenase）為內參，特異性引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，結果采用2－ΔΔCT法進行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 統計學分析 通過GraphPad Prism 6 軟件進行處理，結果以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK?q 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 臟器指數 與正常組比較，模型組大鼠肺臟指數、脾臟指數、肝臟指數、腎臟指數升高（P＜0.05，P＜0.01），胸腺指數降低（P＜0.01），心臟指數無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，云南松松塔高劑量組大鼠肺臟指數、脾臟指數、肝臟指數降低（P＜0.01），胸腺指數升高（P＜0.01）腎臟指數、心臟指數無明顯變化（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠臟器指數（， n＝8）Tab.2 Organs indices of rats in various groups（， n＝8）

表2 各組大鼠臟器指數（， n＝8）Tab.2 Organs indices of rats in various groups（， n＝8）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 組織病理學變化 與正常組比較，模型組大鼠肺組織肺泡壁、支氣管壁中有大量炎癥細胞積聚，肺泡隔膜水腫變厚，導致肺泡空間急劇減少和間質充血；云南松松塔高劑量組明顯減輕了LPS誘導的大鼠ALI 組織損傷，包括水腫、充血、炎癥等，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學變化（HE，×200）Fig.1 Histopathological changes of rat lung tissues in various groups（HE，×200）

3.3 抗炎能力 與正常組比較，模型組大鼠BALF 中TNF?α、IL?6、IL?1β、TGF?β 水平升 高（P＜0.01），IL?10 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組、云南松松塔高劑量組大鼠BALF 中TNF?α、IL?6、IL?1β、TGF?β 水平降 低（P＜0.01），IL?10 水平升高（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠BALF 中炎性因子水平（， n＝8）Tab.3 Levels of inflammatory factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

表3 各組大鼠BALF 中炎性因子水平（， n＝8）Tab.3 Levels of inflammatory factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 抗氧化能力 與正常組比較，模型組大鼠BALF 中SOD、CAT 水平降低（P＜0.01），MDA、NO 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，云南松松塔高劑量組大鼠BALF 中SOD 水平升高（P＜0.01），MDA、NO 水平降低（P＜0.01），見表4。

表4 各組大鼠BALF 中氧化／抗氧化因子水平（， n＝8）Tab.4 Levels of oxidative／anti?oxidative factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

表4 各組大鼠BALF 中氧化／抗氧化因子水平（， n＝8）Tab.4 Levels of oxidative／anti?oxidative factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 肺組織mRNA 相對表達 與正常組比較，其余各組大鼠肺組織中TLR4、NF?κB、TNF?α、IL?6、IL?1β相 對mRNA 表達升 高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，陽性組、云南松松塔高、中劑量組大鼠肺組織中TLR4、NF?κB、TNF?α、IL?6、IL?1β相對mRNA 表達降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織中TLR4、 NF?κB、 TNF?α、 IL?6、 IL?1β 相對mRNA 表達（， n＝8）Fig.2 Relative mRNA expressions of TLR4， NF?κB， TNF?α， IL?6 and IL?1β in lung tissues of rats in various groups（， n＝8）

4 討論

ALI 是一種嚴重的呼吸系統疾病，是急性和持續性肺部炎癥的基礎，可由敗血癥、肺創傷、燒傷等多種因素引起［8］。在ALI 起始和發展階段，中性粒細胞和淋巴細胞招募發揮重要作用［9］。在本研究中，給予ALI 大鼠云南松松塔提取物預處理后，其肺泡壁和支氣管壁中的炎癥細胞大量減少，肺泡隔膜水腫減輕，間質充血得到改善。

LPS 是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，也是重要的炎癥誘導劑［10］。LPS 誘導的ALI 與NF?κB 通路有關［11］。在ALI 中，LPS 被TLR4 識別，從而激活NF?κB［12］，誘導多種促炎因子的釋放，包括TNF?α、IL?1β、IL?6 等［13］，引發炎癥反應和進一步的組織損傷。而TNF?α、IL?1β、IL?6 的產生，會引起NF?κB 的持續激活，從而誘導持續的炎癥反應［14］。因此，抑制TLR4／NF?κB 信號通路的激活能夠改善ALI 炎癥狀態［15］。RT?PCR 結果表明，PE 能夠下調TLR4、NF?κB的mRNA 相對表達，從轉錄水平下調炎癥因子TNF?α、IL?1β、IL?6的mRNA 相對表達，從而減少BALF 中促炎細胞因子TNF?α、IL?1β、IL?6 的釋放，減輕LPS 誘導的ALI 大鼠炎癥水平。

除了炎癥反應外，氧化應激在LPS 誘導的肺損傷病理過程中也發揮重要作用［16］。急性肺損傷發生后，受損細胞釋放大量氧自由基，如NO 等而引發脂質過氧化，從而使生物膜通透性增加，穩定性變差［17］。此外，脂質過氧化終產物MDA 與氨基酸、蛋白質、核酸等生物分子結合會造成這些生物分子失活而產生毒性［18］。因此，提高機體內抗氧化酶如SOD、CAT 活力，降低氧化酶和氧化產物如NO、MDA 等的量則能夠抑制氧化應激，改善急性肺損傷。在LPS 誘導的大鼠ALI 中，云南松松塔提取物顯著增強了ALI 大鼠抗氧化酶SOD 的活力，并降低MDA 和NO 水平。

綜上，云南松松塔提取物能通過抑制TLR4／NF?κB 炎癥信號通路和氧化應激，下調促炎基因TNF?α、IL?1β、IL?6 的相對mRNA 表達，而減少炎癥因子分泌，抑制ROS，增強抗氧化酶活性，從而保護LPS 誘導的大鼠ALI。當然，本研究仍然存在一定的局限性。目前研究發現云南松松塔提取物能夠從轉錄水平調節炎癥，但是否能夠從翻譯水平改善ALI 動物炎癥水平，以及云南松松塔提取物如何調節氧化應激和炎癥信號通路，以及云南松松塔提取物能否預防急性肺損傷后的并發癥，需要我們進一步進行深入研究，從而為云南松松塔的進一步應用提供理論和實驗依據。