龍骨風HPLC 指紋圖譜建立及5 種成分測定

盧汝梅，張進燕，王 肖，楊新洲，韋建華，李 兵*

（1.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧530200； 2.中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074）

壯藥龍骨風為桫欏科植物桫欏Alsophila spinulosa（Wall.ex Hook.）Tryon 的莖干，具有祛風除濕、活血散瘀、清熱解毒、止咳平喘、強筋骨、殺蟲等功效［1?2］，主要分布在中國南部、南亞和東南亞等地［3?4］，具有一定的抗腫瘤、抗菌和鎮痛作用［5?7］，主要含黃酮、三萜、甾體、酚酸等成分［8?12］。藥材中化學成分種類及含量可能會隨著其地理來源、物種和收獲季節的不同而產生變化［13?14］。龍骨風來源廣泛，規格等級復雜，僅憑TLC 或單一成分含量測定難以全面反映其質量。近年來，越來越多的學者采用指紋圖譜結合多成分定量分析的方法進行藥材質量評價［15?18］，故本實驗建立11 批龍骨風HPLC 指紋圖譜，并對其中5 種成分含量進行測定，以期為其科學鑒定和質量控制提供依據。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；UV?1780 型紫外分光光度計［島津（中國）有限公司］；CPA225D 型電子天平［十萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；KQ5200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

甲醇為色譜純［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；其他試劑均為分析純；水為超純水。原兒茶酸（批號110809?201205）、原兒茶醛（批號110810?201608）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；其余對照品為2018 年廣西中醫藥大學中藥化學課題組從龍骨風中分離得到，分別為咖啡酸、反式對羥基肉桂酸、阿魏酸，質量分數均大于98.0%。

11 批龍骨風采自國外內各地，信息見表1，經廣西中醫藥大學壯醫藥學院韋松基教授鑒定為桫欏科植物桫欏Alsophila spinulosa（Wall.ex Hook.）Tryon 的莖干。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條 件 COSMOSIL 5C18?PAQ 色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）?0.1%磷酸（B），梯度洗脫，程序見表2；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm；進樣量15 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于2 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，制得貯備液，取適量置于同一量瓶中，加甲醇稀釋，制成分別含原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對羥基肉桂酸、阿魏酸0.187 9、0.371 0、0.170 4、0.023 5、0.019 8 mg／mL 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取龍骨風粉末（50 目）5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇?1%冰醋酸（70 ∶30）混合液25 mL，稱定質量，超聲45 min，放冷，甲醇?1%冰醋酸（70 ∶30）混合液補足減失的質量，搖勻，濾過，揮干溶劑，甲醇?1%冰醋酸（70 ∶30）定容至5 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得，4 ℃保存備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取藥材（LGF20170428），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣6 次，測得各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取藥材（LGF20170428），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下于0、2、4、8、12、16、24 h 測定，測得各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取藥材（LGF20170428），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜建立 取11 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1”項色譜條件下進樣。

2.4.1 共有峰確定 根據11 批樣品HPLC 色譜圖，并比對15 個共有峰，構建其特征指紋圖譜。由于原兒茶醛在各批樣品中均出現，分離度良好，峰面積較大，故選擇其（5 號峰）作為參照峰。

2.4.2 共有峰歸屬 通過對照品比對，確定5 個共有峰代表的成分，其中4～5 號峰分別確定為原兒茶酸、原兒茶醛，9 號峰為咖啡酸，11 號峰為反式對羥基肉桂酸，15 號峰為阿魏酸，見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.3 相似度計算及對照指紋圖譜生成 11 批樣品指紋圖譜見圖2，將其AIA 數據文件導入中藥指紋圖譜相似度評價系統研究版（2012）進行相似度計算，設置樣品S1 圖譜為參照圖譜，對照圖譜生成方法采用中位數法，時間窗寬度為0.1，自動匹配，生成對照指紋圖譜，見圖3，相似度見表3。

圖2 11 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of eleven batches of samples

圖3 11 批樣品HPLC 指紋圖譜共有模式Fig.3 Common pattern of HPLC fingerprints of eleven batches of samples

表3 11 批樣品相似度Tab.3 Similarities of eleven batches of samples

2.4.4 相似度分析 與對照指紋圖譜比較，各批樣品相似度在0.829～0.948 之間，90.9%在0.850以上，表明不同產地藥材成分相似度高，但仍然存在一定差異。另外，S4、S1、S5、S11、S9、S10相似度較低，其他樣品較高，其中S10 與共有模式圖譜的相似度最低，僅為0.829。

2.4.5 聚類分析 運用SPSS Statistics 22.0 軟件對11 批樣品的共有峰面積進行系統聚類分析，采用組間連接法，以平方Euclidean 距離為度量標準，標準化范圍0～1，結果見圖4。在距離10 內，11批樣品聚為3 類；樣品S1～S5、S8、S11 產地、共有峰面積相近，因此聚為一類；S6～S7、S9 聚為一類；S10 的差異性最大，聚類距離最遠，聚為一類，與相似度評價結果基本一致。

圖4 11 批樣品聚類樹狀圖Fig.4 Dendrogram of eleven batches of samples

2.4.6 主成分分析 在聚類分析的基礎上，運用SPSS Statistics 22.0 對樣品進行主成分分析，主成分的特征值及貢獻率作為主成分選擇的依據。根據降維結果，共挑選出2 個主成分因子，各主成分因子方差貢獻值分別為81.869%、8.253%，累積貢獻值達到90.122%，見圖5，與聚類分析的結果一致。

圖5 11 批樣品主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis plot for eleven batches of samples

2.5 5 種成分含量測定

2.5.1 線性關系考察 取對照品貯備液適量，逐級稀釋，制成對照品溶液，分別精密吸取15 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，發現各成分均呈良好的線性關系，見表4。

表4 各成分線性關系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.2 精密度試驗 取藥材（LGF20170428）粉末5 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1”項色譜條件下進樣6 次，測得原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對羥基肉桂酸、阿魏酸峰面積RSD 分別為0.72%、0.52%、0.53%、0.40%、0.21%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 取藥材（LGF20170428）粉末5 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，于0、2、4、6、8、12、24 h 各精密吸取15.0 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對羥基肉桂酸、阿魏酸峰面積RSD 分別為1.55%、1.28%、0.97%、0.60%、0.31%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5.4 重復性試驗 取藥材（LGF20170428）粉末5 g，精密稱定6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各吸取15.0 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對羥基肉桂酸、阿魏酸峰面積RSD 分別為0.27%、0.32%、0.74%、0.63%、0.32%，表 明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取藥材（LGF20170428）粉末2.5 g，共6 份，精密加入含原兒茶酸（0.177 mg／mL）、原兒茶醛（0.410 mg／mL）、咖啡酸（0.511 mg／mL）、反式對羥基肉桂酸（0.061 mg／mL）、阿魏酸（0.147 mg／mL）的對照品溶液1.00 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1”項色譜條件下進樣15 μL，計算回收率，結果見表5。

表5 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.5 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.5.6 樣品含量測定 取不同產地藥材各5 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，精密吸取15.0 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣，外標法計算含量，結果見表6。

表6 各成分含量測定結果（mg／g）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

本實驗分別對不同提取方法、溶劑種類、提取次數、提取體積、流動相、檢測波長、色譜柱、柱溫、流速等條件進行考察。結果表明，在“2.1”項色譜條件下進樣時，所得色譜圖峰形較好、分離度高，重復性好，因此選擇其作為色譜條件。

本實驗運用HPLC 法建立了11 批樣品的指紋圖譜，并采用中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）建立了共有模式，結果顯示各批樣品相似度為0.829～0.948，表明其指紋圖譜基本一致，品質較穩定。再采用中位數法，經多點校正、自動匹配后共生成了15 個共有峰，指認了其中5 個，分別為原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對羥基肉桂酸、阿魏酸。藥理研究表明，酚酸類成分具有消除自由基、抗炎、抗病毒、抗氧化等［19?20］活性，也與龍骨風功效相關，故本實驗選取這5 種成分作為指標進行含量測定，結果表明同一成分在不同批次樣品中存在較大的差異，可能受藥材生長的地理環境、生長年限、采收季節、儲存條件等因素的影響。

4 結論

本研究首次采用HPLC 指紋圖譜結合聚類分析、主成分分析、含量測定對11 批龍骨風進行研究，所建立的方法準確可靠，重復性好。通過對龍骨風藥材指紋圖譜的初步研究，可為其質量控制提供依據也能為探索譜效關系、明確其主要有效成分奠定基礎。