一測多評法同時測定兩面針中5 種成分

喬麗婭胡鳳云沈 卓黃寶優夏祥華 張占江*

（1.廣西壯族自治區藥用植物園，廣西 南寧530023； 2.廣東省農業科學院蔬菜研究所，廣東 廣州510640； 3.中國科學院高能物理研究所，北京 100049）

兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.為蕓香科花椒屬木質藤本植物，根部入藥［1］，主要分布于我國兩廣、貴州、云南、福建等亞熱帶季風氣候地區［2］，富含多種生物堿類、黃酮類等活性成分［3］，具有抗炎、抗氧化、抗癌、保護心血管系統等作用［4?6］。雖然對兩面針成分分析已有報道［7?9］，但主流的HPLC 法需要所有成分作為對照品，而鹽酸血根堿、白屈菜紅堿、橙皮苷、木蘭花堿分離純化難度大，不易獲得，對照品價格昂貴，從而限制了該方法在實際生產和檢測中的應用。

一測多評法［10?11］是利用中藥有效成分之間的外標內在函數和比例關系，通過測定一種成分而實現多種成分的同步測定，具有成本低、方法簡便等特點，在中藥材多指標質量評價中具有一定的優勢［11?12］。本實驗采用該方法，以含量高、便宜易得的氯化兩面針堿為內標，計算其他4 種成分的相對校正因子，測定其含量，以期為該藥材質量控制提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀（四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱，美國安捷倫公司）；Cary 50 型紫外分光光度計（美國Varian 公司）；KQ5200E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；CP225D 型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）。

1.2 試劑 鹽酸血根堿（批號510001?201101，純度99.3%）、氯化兩面針堿（批號110848?200603，純度99.2%）、白屈菜紅堿（批號111718?201402，純度80.5%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；橙皮苷對照品（批號160406，純度98.0%）購自北京博藝匯科生物技術有限公司；木蘭花堿對照品（批號P11A10L85442，純度98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 藥材 12 批兩面針經廣西藥用植物園標本館黃寶優高級工程師鑒定為兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的根，信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相20%乙腈? 0.1%甲酸（三乙胺調節pH 至4.5）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長273、284 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，70%甲醇溶解并定容至25 mL，制成不同質量濃度貯備液（氯化兩面針堿0.045 6 mg／mL、木蘭花堿0.193 3 mg／mL、橙皮苷0.195 6 mg／mL、鹽酸血根堿0.050 0 mg／mL、白屈菜紅堿0.147 2 mg／mL），置于4 ℃冰箱中保存備用。精密量取1 mL，70%甲醇定容至2、5、10、25 mL，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱定樣品粉末（粒徑≤0.5 mm）1.0 g，置于具塞錐形瓶中，70%甲醇超聲提取30 min，重復3 次（料液比1 ∶6），合并提取液，乙醇定容至50 mL 量瓶中，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 系統適用性考察 吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣，結果見圖1。由此表明，理論塔板數以木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰計，分別為23 611、27 270、20 760、41 923、50 087，分離度均大于1.5，各基線分離良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣5 次，測得木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積RSD 分別為0.45%、0.21%、0.63%、0.33%、0.29%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣，測得木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積RSD 分別為1.29%、0.98%、1.27%、1.08%、0.83%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取同一批供試品（Z2）粉末6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿含量RSD 分別為1.48%、2.24%、1.43%、1.32%、2.36%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批供試品（Z2），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.5 一測多評

2.5.1 相對校正因子計算 采用多點校正法計算相對校正因子（fx／c）［13］，取平均值，公式為fx／c＝fx／fc＝（Mc×Ax）／（Mx×Ac），其中Mc為內參物質量濃度，Ax為待測組分的峰面積，Mx為待測組分的質量，Ac為內參物峰面積。吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下測定，由于氯化兩面針堿較易獲得，價格低廉，而且在樣品中的含量較高，故選擇其作為內標，計算木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的fx／c，結果見表4，表明均有良好的重復性。

表4 各成分相對校正因子Tab.4 Relative correlation factors of various constituents

2.5.2 重復性試驗 選擇Shimadzu WondaCract ODS?2、Tianhe Kromasil C18、Phenomenex Luna C18、Dalian Elite hypersil BDS C18、Agilent Zorbax SB?aq C18色譜柱，計算相對校正因子，結果見表5，可知該方法能滿足定量分析要求。

表5 不同色譜柱對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different columns on relative correction factors

2.6 含量測定結果比較 精密稱取12 批樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表6，通過配對t檢驗［13］分析其差值，發現2 種方法下各成分含量均無明顯差異。

表6 一測多評法和外標法所得結果比較（mg／g）Tab.6 Comparison of results obtained by QAMS method and external standard method（mg／g）

3 討論

2015 年版《中國藥典》 中，兩面針質量評價只測定了氯化兩面針堿含量。本實驗參照文獻［14?15］ 測定5 種成分含量，可用于該藥材質量控制。

參照2015 年版《中國藥典》 氯化兩面針堿的測定方法，分別以不同體積比例的乙醇和甲醇為提取溶劑。結果表明，70%甲醇、無水甲醇中提取效率較高，由于前者成本更低，因此選用其作為提取溶劑。

比較甲醇?0.1%甲酸、甲醇?0.1%甲酸?三乙胺（pH 4.5）、乙腈?0.1%甲酸、乙腈?0.1%甲酸?三乙胺（pH 4.5），發現乙腈?0.1% 甲酸、乙腈?0.1%甲酸?三乙胺（pH 4.5）作為流動相時供試品峰形較好。由于三乙胺與SiO－作用力更強，可降低生物堿吸附，抑制峰拖尾，減少損傷色譜柱，故最終以乙腈?0.1%甲酸?三乙胺（pH 4.5）為流動相。

采用二極管陣列PDA 檢測器對5 種成分進行全波長掃描分析，結果表明木蘭花堿、橙皮苷的最大吸收波長在284 nm 處，而鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿在273 nm處。

本研究分別采用一測多評和外標法對12 個產地的兩面針進行含量測定，發現所得結果的相對偏差均小于3%，證明一測多評法能準確測定該藥材中5 種成分的含量。