基于電子舌表征和化學成分的“譜味”相關性探究川芎辛味物質基礎

楊露萍倪 妮洪燕龍吳 飛沈 嵐

（1.上海中醫藥大學中藥學院，上海201203； 2.上海中醫藥大學上海中醫健康服務協同創新中心，上海201203； 3.上海中醫藥大學中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上海 201203）

中藥五味理論是中藥藥性理論的重要組成部分，“五味”原指中藥“辛、甘、酸、苦、咸”5種滋味，隨著中醫學的不斷發展，五味逐漸與五行、五臟、陰陽等理論相結合，演化為藥物功能分類的標志［1?2］?；瘜W成分是聯系五味“味與效”的基礎［3］。對五味物質基礎的探索一直是五味理論的重點難點，目前多采用歸納總結或受體虛擬對接的方式，缺乏有力的實驗支撐［4?5］。

辛味作為五味之一，能散、能行、能潤、能燥，臨床應用極其廣泛。作為辛味代表中藥之一的川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，其藥性辛溫，重在能行、能散，妙在走竄，上行可達巔頂，下行可入血海［6］。探明川芎辛味物質基礎對于闡明辛味味與效的聯系有重要意義。然目前川芎味效相關研究較多集中于藥效物質基礎方面，味覺物質基礎研究尚且匱乏［7?8］。

電子舌是一種智能味覺仿生系統，基于其類似于人類味蕾工作原理的人工脂膜傳感器技術，可通過感受味覺物質產生味信號對待測樣品進行分析與識別。因此，本實驗以川芎辛味為研究對象，引入電子舌為主要研究手段，并聯合GC 分析其辛味物質基礎。鑒于同科屬中藥具有相似的化學成分，本實驗以科為分類，表征不同科辛味中藥，探究電子舌表征中藥辛味可行性；根據物質組群可拆分原理，探明中藥川芎辛味部位；對不同產地川芎辛味部位電子舌響應值與其主要成分含量進行相關性分析并驗證，以期明確川芎辛味物質基礎，為辛味中藥臨床應用提供依據，并為科學解析五味理論提供參考。

1 材料

1.1 儀器 α?ASTREE Ⅱ電子舌系統（法國Alpha MOS 公司），由7 個味覺傳感器ZZ、JE、BB、CA、GA、DA、JB 和1 個氯化銀參比電極組成；Agilent 7890A 型氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；XP205 型分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；FA2104N 型分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；TGL?18C 高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；Milli?Q 超純水制備儀（密理博上海貿易有限公司）。

1.2 試劑 藁本內酯（批號PRF10042505，純度≥98%）、洋川芎內酯A（批號PRF20071541，純度≥98%），均購于成都普瑞法科技開發有限公司；α?蒎烯（批號E4770050，純度99.2%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；4?松油醇（批號H02J6Q2，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；丁烯苯酞（批號101413?201601，純度≥98%）、阿魏酸（批號 110773?201614，純 度99.0%）、鄰苯二甲酸二乙酯（批號 190047?201403，純度≥98%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、濃鹽酸、濃氨水等均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 材料 32 種不同科辛味中藥信息見表1，10批不同產地川芎信息見表2，均經上海中醫藥大學生藥教研室崔亞君教授鑒定為正品。

表1 32 批樣品信息Tab.1 Information of thirty?two batches of samples

表2 不同產地10 批樣品信息Tab.2 Information of ten batches of samples from different growing areas

2 方法與結果

2.1 電子舌對川芎辛味的表征

2.1.1 中藥水煎液制備 取30 種常規類中藥飲片各10 g，加50 mL 水浸泡30 min 后煎煮30 min，300 目篩過濾，濾渣加入50 mL 水再煎煮20 min，300 目篩過濾，合并2 次濾液，定容至100 mL，5 000 r／min離心15 min，取上清液，超純水稀釋至10 mg／mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。2 種后下類中藥（薄荷、砂仁）各取飲片10 g，加100 mL水煮沸5 min，300 目篩過濾，定容至100 mL，5 000 r／min離心15 min，取上清液，超純水稀釋至10 mg／mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 川芎揮發油制備 飲片打粉，稱取通過2號篩但不能通過4 號篩粉末100 g，加1 000 mL 純水浸泡2 h，水蒸氣蒸餾法提取揮發油8 h，加無水硫酸鈉，4 ℃靜置過夜，讀取揮發油量，于棕色瓶中密封，4 ℃保存。精密吸取5、10、15 μL，10%乙醇定容至100 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，記為Y1、Y2、Y3（分別約相當于生藥量10、20、30 mg／mL）。

2.1.3 川芎堿性部位制備 將上述提取揮發油之后的藥液用300 目篩過濾，濾液在60 ℃以下濃縮干燥，粉碎。取4.0 g 浸膏粉，以100 mL 1 mol／L 鹽酸溶解，濾過，濾液用濃氨水調pH 至9～10，以氯仿40、30、20 mL 萃取3 次，合并氯仿層，60 ℃水浴蒸干，2.0 mL 無水乙醇溶解得堿性部位。精密吸取130、260、390 μL，10% 乙醇定容至100 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，記為J1、J2、J3（分別約相當于生藥量10、20、30 mg／mL）。

2.1.4 川芎酸性部位制備 另取4.0 g 浸膏粉，100 mL pH 11 氨水溶解，濾過，濾液用濃鹽酸調pH 至2～3，以乙酸乙酯40、30、20 mL 萃取3 次，合并乙酸乙酯層，60 ℃水浴蒸干，2.0 mL無水乙醇溶解得酸性部位。精密吸取130、260、390 μL，10%乙醇定容至100 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，記為S1、S2、S3（分別約相當于生藥量10、20、30 mg／mL）。

2.2 電子舌測定方法建立 取100 mL 樣品，置于電子舌專用燒杯中，傳感器浸入樣品中測定120 s，記錄第100～120 s 數據的平均值，每次測量完成后傳感器在去離子水中清洗10 s。每份樣品測試10次，取后3 次數據作分析。

2.3 電子舌對不同科辛味中藥表征 取“2.1.1”項下32 種中藥水煎液，按“2.1.2”項下方法測試，結果作主成分分析（Principal composition analysis，PCA），見圖1，圖中PC1 與PC2 分別代表第一主成分與第二主成分的方差貢獻率，其值越大，越能反應樣品整體信息［9］，PCA 圖中各樣品之間相對位置的遠近能反映樣品間的相似度與區分度。由圖1 可知，傘形科、姜科、唇形科、蕓香科、木蘭科、樟科各同科辛味中藥（相同顏色標記）相互聚集，即其味覺在電子舌上的響應相似，由于同科中藥具有類似的化學物質基礎，推測電子舌對同科中藥的特殊味覺化學成分或結構有相同的響應?；陔娮由嗄軐悠氛w味覺信息進行數字化定量，結合化學成分分析，其可作為探究具體辛味味覺物質成分的手段。

圖1 電子舌表征不同科辛味中藥的主成分分析圖Fig.1 PCA image of pungent herbs from different families by ET

2.4 電子舌對川芎辛味部位表征 川芎水提液用10%乙醇稀釋至10 mg／mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，記為CX；另取“2.1.1”項下川芎揮發油Y1、Y2、Y3，川芎堿性部位J1、J2、J3，川芎酸性部位S2、S3，按“2.1.2”項下方法測試，進行主成分分析，再利用電子舌自帶分析軟件AlphaSoft 14.2 計算不同樣品之間的歐氏距離（反映樣品之間區分度），結果見圖2。由此表明，川芎揮發油與川芎距離最近，而酸性、堿性部位相對較遠，提示電子舌對川芎揮發油與川芎的響應最類似，對兩者中某些共同物質或結構有相同的響應，并且揮發油對川芎味覺信息的貢獻度最大。

圖2 電子舌表征川芎辛味部位Fig.2 ET characterization for pungent part of L.chuanxiong

2.5 電子舌對不同產地川芎辛味部位表征 取10批樣品（CX1～CX10）揮發油各5 μL，10% 乙醇定容 至100 mL，0.45 μm 微孔濾膜過 濾，按“2.1.2”項下方法測試，各電極響應值的雷達圖見圖3。由此可知，不同電極對不同產地的川芎揮發油均有一定區分能力，其中以ZZ、JE、DA最強。

圖3 電子舌表征不同產地川芎揮發油雷達圖Fig.3 ET Radar map of volatile oils of L.chuanxiong from different growing areas

2.6 川芎揮發油中6 種成分的GC 同步定量表征

2.6.1 色譜條件 B?624 色譜柱（0.45 mm×30 m，2.55 μm）；體積流量1.5 mL／min；進樣量1 μL；不分流；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度260 ℃；程序升溫，初始溫度60 ℃，以10 ℃／min升至160 ℃，保持6 min 后，以5 ℃／min 升至200 ℃，保持8 min 后，以5 ℃／min 升至230 ℃，保持10 min。見圖4。

圖4 川芎揮發油GS 色譜圖Fig.4 GS chromatogram of volatile oil of L.chuanxiong

2.6.2 溶液制備

2.6.2.1 對照品貯備液 取α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸、丁烯苯酞、藁本內酯、洋川芎內酯A 對照品適量，精密稱定，甲醇定容，制成質量濃度分別為1.272 0、7.544 0、5.880 0、7.650 0、8.450 0、6.595 0 mg／mL 的溶液。

2.6.2.2 內標溶液 取鄰苯二甲酸乙酯對照品適量，精密稱定，甲醇定容，制成質量濃度為10.685 0 mg／mL 的溶液。

2.6.2.3 對照品溶液 精密吸取各對照品貯備液適量，甲醇定容，制成α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸、丁烯苯酞、藁本內酯，洋川芎內酯A 質量濃度分別為0.254 4、0.377 2、0.294 0、0.382 5、4.225 0、0.824 4 mg／mL 的貯備液，分別精密吸取其與內標溶液適量，甲醇定容，即得。

2.6.2.4 供試品溶液 取樣品適量，精密稱定，再精密加入適量內標溶液，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.3 方法學考察

2.6.3.1 線性關系考察 取“2.6.2.3”項下貯備液50、100、150、200、400、800 μL，各加入50 μL 內標溶液，甲醇定容，在“2.2.1”項色譜條件下進樣。以各成分質量濃度為橫坐標（X），各成分峰面積與內標峰面積比值為縱坐標（Y）進行回歸，得α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸、丁烯苯酞、藁本內酯、洋川芎內酯A 方程分別為Y＝2.045 1X＋0.002 3（r＝0.999 1）、Y＝2.283 7X＋0.007 1（r＝0.999 8）、Y＝0.885 4X－0.002 4（r＝0.999 3）、Y＝2.975 5X＋0.005 9（r＝0.999 6）、Y＝1.707 6X＋0.003 3（r＝0.999 7）、Y＝2.255 0X－0.018 0（r＝0.999 4），在各自范圍內線性關系良好。

2.6.3.2 精密度試驗 取混合對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下連續進樣6 次，測得以上6種成分峰面積與內標峰面積比值的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.6.3.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣，測得以上6 種成分峰面積與內標峰面積比值的RSD 均小于3%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.6.3.4 加樣回收率試驗 取同一批川芎揮發油，平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，測得以上6 種成分平均加樣回收率為95%～105%，RSD 均小于3%。

2.6.4 樣品含量測定 取10 批樣品揮發油制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，內標法計算含量，結果見表3。

表3 不同產地川芎揮發油中各成分含量測定結果（%，， n＝3）Tab.3 Results of content determination for various constituents in volatile oils of L.chuanxiong from different growing areas（%，， n＝3）

表3 不同產地川芎揮發油中各成分含量測定結果（%，， n＝3）Tab.3 Results of content determination for various constituents in volatile oils of L.chuanxiong from different growing areas（%，， n＝3）

2.7 基于電子舌表征與化學成分相關性分析川芎辛味物質基礎

2.7.1 川芎揮發油成分含量與電子舌響應的相關性分析 采用SPSS 22.0 軟件作川芎揮發油中6 種成分與電子舌7 枚電極響應的Pearson 相關性分析，結果見表4。由表4 可知，丁烯苯酞含量與電極ZZ、JE、BB、GA 響應呈極顯著正相關，與DA、JB 響應呈顯著正相關；藁本內酯含量與電極CA 響應呈正相關；洋川芎內酯A 含量與電極DA 響應呈顯著負相關，表明丁烯苯酞、洋川芎內酯A、藁本內酯的含量高低對電子舌響應影響顯著，而其他萜類、酚酸類（如α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸）則無顯著影響，提示川芎辛味的味覺物質可能主要為其揮發油中的苯酞類成分。

表4 川芎揮發油中6 種成分含量與7 枚電極響應的相關性分析Tab.4 Correlation analysis between contents of six constituents in volatile oils of L.chuanxiong and responses of seven electrodes

2.7.2 川芎辛味物質基礎的電子舌驗證 精密稱取α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸、丁烯苯酞、藁本內酯、洋川芎內酯A 與川芎揮發油各5 mg 于10% 乙醇中，0.45 μm 微孔濾膜過濾，按“2.1.2”項下方法測試，進行PCA 分析，并計算不同樣品之間歐式距離。如圖5 所示，丁烯苯酞、藁本內酯、洋川芎內酯A 與川芎揮發油距離相近，而α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸則距川芎揮發油距離較遠，進一步驗證丁烯苯酞、藁本內酯、洋川芎內酯A 是川芎辛味的物質基礎。

圖5 電子舌表征川芎揮發油6 種成分Fig.5 ET characterization of six constituents in volatile oil of L.chuanxiong

3 討論

人工口嘗是最主要的五味標定方法，然而其主觀性使之不能成為確定的統一標準。電子舌技術最先應用于食品飲料行業，近年來陸續有學者將其移植到中藥五味的標定中，突破了五味確定標準不統一的壁壘［10］。而藥效物質基礎研究則偏離五味核心理論，出現以藥效指標以偏概全解讀藥味的思維混亂問題。理清中藥藥味物質基礎是科學解析五味理論的基石，基于電子舌可客觀、量化表征味覺信息的特點，有望成為探明藥味物質基礎的有力手段。

然而，電子舌對五味之辛味的表征區分尚未能取得理想成果［11?12］。杜瑞超等［13］以22 種常用中藥水煎液為對象，成功在電子舌上歸屬出中藥“酸、甜、苦、咸”四味劃分區域，而未歸屬出辛味區域。曹煌等［14］以辣椒素為辛味藥陽性對照，于電子舌上表征歸屬中藥藥材、物質組群及單體成分的藥味，其結果規律性并不明顯。目前，在傳統五味分類方式下，辛味藥在電子舌上無特定歸屬區域，且缺乏合適的陽性對照物質，使電子舌對中藥辛味藥的研究陷入瓶頸。

本研究以科為分類，基于電子舌表征不同科辛味中藥，同科辛味中藥相互聚集，不同科辛味中藥相互分離，呈現明顯的規律性。按科分布是辛味中藥在電子舌上的響應規律，本質上也是電子舌對不同物質基礎的響應規律。因此，本實驗在按科分類的基礎上，以電子舌作為分析中藥辛味物質基礎的有效手段，并借鑒中藥譜效研究思路，對川芎辛味的仿生電子舌味覺表征信息與化學指紋圖譜的“譜味”相關關系進行研究，找出顯著影響電子舌響應的具體味覺成分，此法可為中藥五味理論的物質基礎研究提供一種可行的方法。

雙變量相關性分析常用于度量2 個連續變量之間相關趨勢與程度［15］，本研究對不同產地川芎揮發油電子舌響應值與成分含量進行雙變量相關性分析，以揭示川芎揮發油中主要辛味味覺成分以及對此響應敏感的電極。實驗所用傳感器電極為電位型多通道類脂膜，采用不同材料的類脂膜模擬不同特性的味覺細胞，通過影響膜兩側電勢變化綜合反映樣品味覺信息［16］。電子舌對同一類味覺物質有類似的響應模式［17］，由結果可知，藁本內酯、洋川芎內酯A 與丁烯苯酞3 種苯酞類成分與川芎揮發油響應特征相似，表明其相同的味覺物質基礎。同時，電子舌也能在同一類相似味覺中區分化學物質［18］，結果顯示，電極CA 對藁本內酯響應顯著，電極DA 對洋川芎內酯A 響應顯著，而電極ZZ、JE、BB、GA、DA、JB 均對丁烯苯酞響應顯著，同一電極對不同物質敏感性不同。