白藜蘆醇保護三氧化二砷的心臟毒性研究進展

吳夢婷，張文君*，張國鋒，楊 碩，陳泳霖

（1.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江 哈爾濱150076； 2.黑龍江生物科技職業學院，黑龍江 哈爾濱 150025）

三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3，ATO），俗稱砒霜，是一種古老的毒物也是一味傳統的中藥。自上世紀70年代中國科學家首次發現ATO 具有治療急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的作用以來，三氧化二砷以其對癌癥和白血病較高的治愈率，頗受醫藥研究者的關注［1］。但因其治療過程中產生嚴重的心臟毒性而限制了應用。白藜蘆醇（resveratrol，Res）分子式C14H12O3，是一種天然含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，主要來源于中藥材虎杖中，也廣泛存在于葡萄、桑葚、花生等植物中［2］。除抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等藥理作用外，Res還被認為是一種潛在的心臟毒性保護藥物［3］。有研究表明，Res 在降低ATO 治療時產生的心臟毒性方面具有一定的潛力［4］。本文介紹了關于ATO 的藥理作用和導致心臟毒性的機制、Res 在治療心血管疾病方面的作用機制，并對近年來二者的聯合應用進行了綜述，以期為后續的臨床研究提供借鑒。

1 ATO 藥理作用

ATO 在胃癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均發現具有一定的治療作用，在治療APL 方面效果較好［5］。研究發現ATO 可通過抑制不同的細胞時期腫瘤細胞增殖，下調腫瘤細胞端粒酶的活性改變細胞周期蛋白和凋亡蛋白的表達誘導腫瘤細胞的凋亡，調控多種腫瘤基因，抑制腫瘤細胞侵襲轉移等機制治療多種腫瘤疾病。此外，ATO 可通過誘導腫瘤細胞產生活性氧物質（reactive oxygen species，ROS），下調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達抑制腫瘤細胞的生長和轉移，同時，ATO 活化Caspase 并下調線粒體膜電位誘導腫瘤細胞凋亡［6?9］。

APL 發病機制主要由于早幼粒細胞白血病蛋白（promyelocytic leukemia protein，PML）基因和維甲酸受體α基因（retinoic acid receptor alpha gene，RARα）異位、斷裂、互換產生PML?RARα 融合基因抑制轉錄使髓系細胞異常分化且停留在早幼粒細胞階段［10］。ATO 可與PML 基因上“鋅指結構”中的半胱氨酸殘基結合，使融合基因寡聚化，再通過泛素?蛋白酶體途徑（UPP）促進融合蛋白SUMO 化修飾并降解。PML?RARα 的降解解除了早幼粒細胞的分化阻滯，最終導致APL 細胞的凋亡［11］。

2 ATO 誘導心臟毒性機制

ATO 在治療期間發現可致患者多種臟器損傷，其中以心臟毒性尤為嚴重［12］，主要包括（亞）急性心臟毒性和慢性心臟毒性兩種，前者包括改變心室復極期、QT 持續時間延長、心律不齊、急性心力衰竭、心肌炎?心包炎樣綜合征等癥狀；后者主要為無癥狀的左心室功能障礙、收縮或舒張功能障礙、擴張型心肌病，嚴重者甚至發生心源性猝死［13?14］。目前，ATO 可能誘導心臟毒性的機制諸多，主要包括氧化應激損傷、細胞內Ca2＋穩態的破壞和干擾多條信號通路等［15?16］。

2.1 氧化應激反應 心肌細胞在正常生理條件下會產生非常低濃度的ROS，并通過正常細胞清除機制排出。隨著濃度增加，ROS 不再通過細胞清除機制排出而經鏈式反應擴散，使細胞中ROS 濃度過高導致氧化應激反應。在ATO 治療期間過度生成的ROS 會破壞心臟細胞內源性抗氧化系統，并導致DNA 損傷［17］。ROS 包括多種（非）自由基如超氧基、羥基自由基和過氧化氫，會破壞DNA、脂質、蛋白質等細胞成分并最終導致細胞凋亡［18］。Hemmati 等［19］在探究鞣花酸預防三氧化二砷對大鼠的心臟毒性時，經實驗發現給予ATO 48 h 后，與對照組相比，用ATO 處理的大鼠心臟組織勻漿中的谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平無性變化，但使用比色法確定心臟組織勻漿中的谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）水平時發現，GPx 水平增加。由此可說明ATO 可以造成心肌細胞氧化應激反應引發心臟毒性。

2.2 Ca2＋穩態的破壞 細胞內Ca2＋的積累是ATO 治療時產生ROS 的主要原因之一，ATO 會增加心臟Ca2＋電流，改變心臟動作電位的平穩期［20］。細胞內Ca2＋濃度增加的機制之一是人鈣調素依賴蛋白激酶（CaMKII）的活性增強，SERCA 蛋白是心肌肌漿網Ca2＋?ATP 酶，可調節心肌細胞鈣穩態。ATO 增強CaMKII 活性，致使SERCA 蛋白功能受損；同時，CaMKII 通過激活L 型Ca2＋通道來增加Ca2＋向細胞質的遷移，激活caspase?2 并誘導心肌細胞凋亡。此外，細胞質Ca2＋的增加會改變線粒體通透性，從而將細胞色素C 釋放到溶質 中引起心肌細 胞凋亡［21］。Zhang 等［22］圍繞ATO 對成年大鼠心室肌細胞心臟收縮的作用及其對Ca2＋瞬變的影響進行探究，與對照組相比，ATO 增加了靜息Ca2＋比率，增加了肌節縮短的幅度、最大馳豫速度和縮短速度，并降低了Ca2＋瞬變衰減率（該值代表Ca2＋通過SECRA 從細胞質中去除的速度），即ATO 抑制了SECRA 的活性。此外ATO 同時上調CaMKII 表達，并激活內質網（ER）應激反應，最終誘發劑量依賴性和時間依賴性的異常心肌細胞收縮，引起心肌損傷。Chen 等［23］在探究ATO 誘導大鼠QT 延長的原因時發現，與對照組相比，全細胞膜片鉗記錄的動作電位持續時間（APD）和離子電流數據顯示，經ATO 處理后的L 型ICa2＋上調，穩態活化曲線更趨于負電位，同時，內向整流IK1 下調并由負電位向正電位轉移；ATO 組心電圖顯示QT 顯著延長約36.4%，APD、APD50 和APD90 分別延長近74.4%、41.8%、74.8%；由此說明，Ca2＋的積累以及L 型ICa2＋、內向整流IK1 的改變可能是導致QT 和APD 延長的原因之一。

2.3 干擾信號通路 砷化物作用時產生的ROS 與NO 結合形成過氧化氫亞硝酸鹽，上調有關炎癥因子如NF?κB、白介素6（IL?6）等誘發動脈粥樣硬化。此外亞砷酸鹽會降低內皮型一氧化氮合酶（eNOS）和蛋白激酶B（AKT）的活性，從而降低NO 的生物利用度，誘發血管內皮功能障礙和心血管并發癥［24］。眾所周知，hERG 基因編碼K＋通道的α 亞基，當阻滯hERG 基因表達時，心臟APD 延長并最終導致QT 延長。研究表明，使用ATO 會阻礙hEGR 功能并導致miR?21 表達增加；此外，NF?κB 也在炎癥過程中破壞hEGR 功能進而增加miR?21 的表達，二者均可因miR?21 表達增加最終引起心臟毒性，但也可由此考慮通過維持NF?κB 途徑抑制心臟毒性［25］。另有研究發現，在ATO 治療的豚鼠體內施用轉化生長因子（TGF?b）信號傳導拮抗劑后很大程度上抑制了間質纖維化和QT 間期延長，并消除了ATO 治療的豚鼠中TGF?b1、hERG 的異常表達，由此說明調節TGF?b 信號傳導也可能是治療ATO 誘導的QT 間期延長的手段之一［26］。

3 Res 抗心血管疾病的作用機制

Res 抗心血管疾病的作用的最早發現源于法國悖論現象的啟發，紅葡萄酒中的Res 具有抗氧化作用，可抑制低密度脂蛋白的氧化［27?28］。研究發現，Res 主要通過調節各種信號通路如AMPK 通路、SIRT1 通路、Nrf2 通路、NF?κB通路來增強內源性抗氧劑系統中的抗氧化酶如血紅素加氧酶1（heme oxygenase?1，HO?1）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的表達，發揮抗氧化應激損傷、抗血小板聚集、調節脂質代謝等藥理活性，從而實現抗心肌細胞凋亡保護心臟的作用［29?30］，見圖1。

圖1 白藜蘆醇通過調節信號通路的抗氧化機制

首先，Res 可直接抑制環磷酸二酯酶，增加環腺苷酸水平，也可刺激AMPK 介導的磷酸核糖轉移酶表達，增加SIRT1 輔基的輔基NAD＋水平從而增加SIRT1 活性；其次，Res 作為一種抗氧化劑，可通過上調細胞防御基因的表達或直接清除多種ROS ／ RNS 保護細胞，也可通過Nrf2／ARE和SIRT1 通路促進內皮細胞產生eNOS 抑制細胞生成ROS；此外，Res 可在AMPK 通路中抑制p38 MAPK 活化的同時直接阻斷NF?κB 信號通路共同發揮抗炎的作用，避免因炎癥反應造成的心血管損傷［31?32］。Ma 等［33］研究發現，Res抑制了小鼠單核細胞巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）中NO 的產生和IL?6 的分泌，同時還能抑制IκBα 的磷酸化和NF?κB 從細胞質到細胞核的轉運，最終發揮抗炎作用。Guo 等［34］將新生大鼠心肌細胞分別于無葡萄糖、含有或不含Res 的30 mmol／L 高葡萄糖環境中培養，并用熒光探針DHE 估計心肌細胞內ROS 的細胞內水平，與空白組相比，暴露于高葡萄糖的心肌細胞中紅色熒光的強度顯著增強且強于對照組，說明Res 可抑制細胞內ROS 的產生進而保護心肌細胞。

4 Res 與ATO 的聯合應用

近幾十年來，ATO 被認為是急性早幼粒細胞白血病治療的突破，盡管ATO 在治療APL、ANPL、抗腫瘤方面有一定的治療效果，但其誘發的心臟毒性始終是亟待解決的問題。有臨床數據顯示，半數使用ATO 的患者出現QT 間期延長的不良反應，部分患者出現尖端扭轉型心動過速癥狀［35］。近年來，科學家發現Res 與ATO 聯合使用時可通過促進細胞凋亡來增強ATO 的抗腫瘤效果，同時，還可以通過維持GSH 的還原態抑制自由基的形成等途徑在一定程度上抑制正常細胞凋亡，進而減輕ATO 所產生的心臟毒性［36］。

4.1 Res 增強ATO 抗腫瘤效果 Res 對多種腫瘤細胞具有的抑制活性且具有殺傷作用，可對腫瘤的起始、促進、發展3 個階段均有抑制作用，可作為天然的化學防癌劑［37］。目前有研究發現，Res 可通過促進腫瘤細胞凋亡作用協同ATO 抗腫瘤。Edward 等［38］將由BCR?ABL 表達的白血病細胞系K562、KT1 和急性髓性白血病細胞系U937 暴露于ATO 中，同時加入不同濃度的Res。結果發現且抗白血病的效果與Res 的濃度呈正比，Res 與ATO 的組合產生比單獨使用二者均有更佳的作用效果。通過蛋白染色結果發現，ATO 通過誘導細胞凋亡機制可治療白血病，當ATO 與Res聯合使用時會增強誘導細胞凋亡的作用。Gu 等［39］在探究Res 和ATO 對人肺癌細胞A549 作用效果時發現，單獨使用Res 時，隨著其濃度的增加，A549 細胞的存活率逐漸下降；Res 與ATO 聯合使用組較單獨使用ATO 組的A549 細胞凋亡百分比增加、GSH 含量降低、ROS 含量增加以及線粒體膜電位下降；此外，經谷胱甘肽合成酶抑制劑BSO 處理后，二者聯合使用所誘導的A549 細胞凋亡百分比由30%增至77%，且A549 細胞內GSH 含量降低而ROS 含量升高，由此認為Res 與ATO 聯合使用，可降低A549 細胞內GSH 含量從而產生ROS，最終導致線粒體膜電位下降以及Cas?3 活化，誘導A549 細胞凋亡。

4.2 Res 降低ATO 引起的心臟毒性

4.2.1 Res 對正常細胞凋亡的抑制作用 和絕大多數抗腫瘤藥物類似，ATO 治療癌癥的不良反應之一是導致正常細胞凋亡，其誘導細胞凋亡的途徑主要包括DNA 的破壞、活性氧的產生、心肌離子通道的改變。NO 在增加心肌細胞的存活中起著至關重要的作用。還顯示出NO 可以通過維持線粒體膜并調節功能來防止ROS 的產生和心肌細胞凋亡［40］。Res 可以通過對抗細胞中的氧化損傷來減輕ATO 誘導的心臟毒性，同時，其也通過抑制ATO 誘導的細胞凋亡來保護正常細胞免于細胞死亡。研究發現，對野生型小鼠灌注Res 后，心肌梗塞有所改善、缺血后心室功能改善以及心肌細胞凋亡減少；對iNOS基因敲除小鼠灌注Res 后，心臟中缺血性心室功能未到改善，心肌梗死面積和心肌細胞凋亡也未產生減小和降低；而對使用iNOS 抑制劑的野生型小鼠灌注Res 后，Res 保護心肌細胞的作用被抑制；由此說明，Res 的心臟保護作用與其能上調NO 的能力有關［41］。Chen 等［42］給予人支氣管上皮細胞Res 24 h 后，因ATO 所產生的ROS 水平降低，并且對脂質過氧化反應、染色體及DNA 損傷、細胞凋亡等有所抑制。此外，Res 降低了含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase?8、caspase?9、caspase?3 的活性，抑制了ATO 引起的caspase?3 過表達，同時其可維持肺細胞中的GSH 平衡，最終實現抑制死亡受體（death receptor）和線粒體凋亡。

4.2.2 維持Nrf2?HO?1 途徑的平衡 據報道，Nrf2 可以通過上調細胞保護因子即NADPH 來激活氧化還原酶1（NQO1）、HO?1 以及GSH 和CAT 來抑制細胞氧化［43］。早期已有研究發現Res 可通過維持Nrf2?HO?1 途徑的平衡表達，促進細胞中的砷流出，從而改善ATO 治療APL 時產生的心臟毒性［44］。Mondal 等［45］在乳腺上皮MCF10 A 細胞的研究中發現Res 在改善ATO 誘導的細胞毒性的同時，可與ATO 共同作用誘導表達信號蛋白Nrf2，從而進一步誘導NQO1 輔酶的表達，增強治療效果。另有實驗發現［46］，與單獨使用ATO 相比，Res 與ATO 聯合使用可以通過維持Nrf2?HO?1 途徑平衡而維持還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽（GSH?GSSG）的比例以及Nrf2 與HO?1 的mRNA 表達，使得由于因ATO 治療作用而釋放的ROS 降低，同時Res 促進了心肌細胞中ATO 的外排，最終緩解了心肌細胞的損傷。

4.2.3 Res 對QT 間期延長的抑制作用 研究［47］表明，在小鼠模型中Res 緩解了由于給予ATO 造成的小鼠血漿中乳酸脫氫酶活性增加、SOD 和GPx 活性降低，以及ROS 水平和Ca2＋通道異常等現象，最終抑制了ATO 誘導的QT 間期延長，增加了心肌細胞活力并抑制了細胞凋亡。為測試Res 是否可以減輕ATO 誘導的Ca2＋電流增加，Yan 等［48］通過共聚焦激光掃描顯微鏡測量新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）內的Ca2＋電流，結果顯示，經ATO 處理的心室心肌細胞Ca2＋電流增加了95.46%，高于對照組，在Res 與ATO 聯合使用后，降低了ATO 誘導的Ca2＋累積，進而縮短了QT 間期。Hsp70 和Hsp90 是hERG 生化成熟所必需的蛋白，ATO 可抑制hERG 通路而降低hERG 電流［49］。研究發現［50］，Res 縮短了ATO 引起的豚鼠心室肌細胞的動作電位持續時間，正常對照組豚鼠心室肌細胞APD 為429.1±26.5 ms，ATO 組豚鼠心室肌細胞APD 延長至（948.3±63.7）ms，ATO 與Res聯用組相比ATO 組縮短APD 至（522.6±26.3）ms，此外，單獨使用Res 對Hsp70 ／ Hsp90 蛋白幾乎無作用，但與ATO聯用時可下調ATO 引起的Hsp70 和Hsp90 過表達，使心室肌細胞的動作電位持續時間降低，減輕了ATO 引起的心臟毒性。

5 展望

ATO 在治療急性早幼粒細胞白血病有良好的治療效果，并在胃癌、肺癌等惡性腫瘤方面有一定的治療作用。盡管ATO 有巨大的發展潛力，但由于嚴重的心臟毒性，限制其廣泛應用。近年來，Res 以其良好的抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等諸多藥理活性在心腦血管疾病和抗腫瘤方面被廣泛關注，Res 不僅可通過抗氧化、抗血小板聚集、維持Nrf2?HO?1 途徑的平衡、縮短QT 間期以及促進細胞內的砷外排等途徑保護由ATO 誘發的心肌細胞毒性；同時，二者的聯合使用增強了抗腫瘤的作用效果，其作用機制可能由于Res 可抑制正常細胞凋亡的同時通過改變線粒體膜電位協同ATO 誘導腫瘤細胞凋亡，但具體的作用機制尚不明確，仍需在今后更深入的研究中發現。相信隨著研究的不斷深化，Res 與ATO 的聯合使用應用于臨床指日可待。