電霧式檢測器在中藥分析中的應用

袁明昊，魏藹玲，劉紅梅，劉雨詩，葉 強，郭 力

（成都中醫藥大學藥學院西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137）

液相色譜自1903 年發明至今取得了令人矚目的進展，HPLC 法是最廣泛的分析手段之一。隨著HPLC 應用的持續增加，對其性能及與之搭配的檢測器的需求也越來越高［1］。目前紫外檢測器（Ultraviolet detector，UV）是HPLC使用最廣泛的檢測器，但當被測物缺乏強生色團時，紫外檢測器便 不適用［2］。電霧式 檢測器（Charged aerosol detector，CAD）是ESA 公司于2004 年10 月推出的具有專利技術的一種新型HPLC 檢測器［3］，其響應值不依賴于被測物質的光學性質和離子化效率，能檢測全部非揮發性和很多半揮發性物質，可替代紫外檢測器檢測非紫外或弱紫外活性的化合物［4］，目前已廣泛應用于藥物的含量測定、雜質控制和輔料評價等相關領域［2］。

中藥在我國具有數千年的歷史，是中華民族的文化瑰寶，對中華民族的繁衍生息做出了重大的貢獻，如今對于中藥的研究不僅局限于疾病的防治，其藥效物質基礎與質量控制等問題亦成為研究的重點，但由于中藥化學成分的復雜性使中藥成分分析一直存在分離難度大，分析時間長等問題［5］。近年來CAD 作為一種新型通用型檢測器在中藥分析領域中表現出廣泛的適用性，尤其適用于皂苷、糖類和生物堿類等無紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析與檢測［6］。本文概述了CAD 的原理及其在中藥成分分析中的應用進展。

1 CAD 簡介

1.1 CAD 檢測器原理 CAD 檢測器是一種通用型檢測器，其響應依賴于分析物的初始質量濃度而與分析物的化學性質無關。首先，霧化器霧化樣品溶液撞擊碰撞擋板形成溶質顆粒，較小的溶質顆粒經干燥管干燥后在碰撞室中與帶正電的氮氣粒子碰撞產生電荷轉移，隨后帶電荷的溶質顆粒將其電荷轉移至收集器，通過靜電檢測器檢測溶質帶電量由此產生信號電流［6］。

1.2 CAD 與HPLC 常用檢測器性能對比 檢測器是HPLC系統的重要組成部分，充當著“眼睛”的角色，面對中藥中復雜的化學成分，選擇恰當的檢測器尤為重要。HPLC法常用的檢測器有UV、示差折光檢測器（Refractive index detector，RID）、熒光檢測器（Fluorescence detector，FLD）、質譜檢測器（Mass spectrometry，MSD）、蒸發光散射檢測器（Evaporative light?scattering detector，ELSD）和電霧式檢測器（CAD）等［7］。其中UV 適用于測定含有紫外生色團的化合物［8］；RID 在靈敏度上具有局限性，且無法進行梯度洗脫［9］；FLD 應用范圍較窄，適用于檢測能激發熒光的化合物或衍生后能激發熒光的化合物；MSD 的儀器使用成本較高，且儀器對實驗人員要求較高，不利于廣泛的應用及推廣［10］；ELSD 與CAD 二者都是基于霧化－氣溶膠原理的HPLC 檢測器，通過霧化蒸發液相色譜流動相后對目標化合物進行檢測，均可用于檢測無紫外吸收或吸收較弱的化合物。兩者區別在于CAD 是基于帶電粒子的電信號，而ELSD 則是基于目標化合物的散射光信號［11］，且相對于ELSD 而言，CAD 的靈敏度更高，對同一化合物的檢出限平均比ELSD 低一個數量級［12］；CAD 生成的信號受霧滴大小或霧滴大小分布情況的影響較?。?3］；每臺電霧式檢測器在出廠前已固定好了一個最佳條件無法改變，且受環境影響很小，故CAD 的重現性更好；CAD 的檢測范圍更寬，可從μg?pg 跨越4 個數量級；CAD 的維修費用更低，ELSD 需將樣品全部霧化進行檢測，而CAD 只有少部分樣品進入干燥管進行后續檢測，因此CAD 儀器內部的污染幾率較ELSD更低且電暈電極的使用壽命也明顯高于氘燈［1］；在梯度洗脫條件下，CAD 比ELSD 更敏感［14］。與其他檢測器比較，CAD 具有的一大優點是設置參數少（只需調節內部壓力），平衡時間短，安裝、操作簡單，為實驗操作人員帶來了方便［1］。各種HPLC 分析常用檢測器的性能比較見表1。

表1 HPLC 常用檢測器的主要性能一覽表

2 CAD 在中藥成分分析中的應用

2.1 分析糖類化合物 小分子的脂溶性成分一直是中藥藥效物質基礎的研究重點，但近年來中藥及其制劑中的單糖、寡糖以及多糖越來越多的成為藥效物質基礎研究的重要對象。糖類具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫等多種生物活性［15］，目前UV、二極管陣列檢測器（Diode array detector，DAD）和FLD 檢測器用于糖類物質的檢測均需柱前衍生化，過程繁瑣。ELSD 和RID 雖不需衍生化，但RID 的靈敏度較低，無法進行梯度洗脫，且易受溫度和流動相的影響，在進行多組分分析時效果不佳。ELSD 的靈敏度較高且可進行梯度洗脫，但由于其結構的特點，在耐用性與穩定性方面存在不足［16?17］。CAD 是一種通用型質量檢測器，其應用于糖類檢測在靈敏度、穩定性等方面優于其他檢測器，尤其在分析測定單糖和二糖等低聚糖具有較好的效果［16］。張素紅等［16］首次建立了使用HPLC?CAD 法同時測定白茅根樣品中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。結果3 種糖類成分分離完全，方法學考察各項內容均符合含量測定要求。張雪等［17］建立了30 min 內同時測定白及中果糖、甘露糖、葡萄糖和蔗糖含量的HPLC?CAD 方法，其測定結果較蒽酮?硫酸比色法的特異性與準確性均具有明顯的提高。Li 等［18］利用微波輔助提取法和HPLC?CAD 法同步測定了菊科、桔?？坪蛙绮菘?2 種植物中11 種菊粉型低聚果糖（FOS）（DP3?DP13）的含量，這也是首次報道不同種屬植物中FOS 的含量對比，將有助于中藥資源的質量評價。此外，CAD 在黃芪［19］、人參［20］等多種植物的糖類分析中，均取得令人滿意的結果。

2.2 分析皂苷類化合物 皂苷類化合物主要分布于陸地高等植物中，如人參Panax ginsengC.A.Mey.、柴 胡Bupleurum chinensie DC.、三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 等，具有抗腫瘤、抗菌、解熱、鎮靜、抗抑郁等生物活性［21］。皂苷類化合物通常無紫外吸收或僅為末端吸收，UV 對于這類化合物的檢測不穩定，并且在梯度洗脫時容易出現基線漂移。ELSD 對皂苷的檢測靈敏度高于UV 的末端波長檢測，但對低含量成分的檢測重復性差［22］，而CAD 檢測器能較好的解決這些問題。黃芪甲苷在使用UV對其進行檢測時需將樣品進行衍生化處理，但衍生化過程復雜且測定樣品所需時間較長，目前多采用ELSD 進行檢測。劉興國等［23］比較了HPLC?CAD 與HPLC?ELSD 法應用于黃芪甲苷含量測定的優劣，結果表明CAD 和ELSD 的方法學精密度和對數線性關系均良好，但CAD 的測定檢出限和定量限比ELSD 低1 個數量級且CAD 的色譜峰對稱性要好于ELSD。此外，廖強等［24?25］也使用CAD 檢測器分別對黃芪及其復方中黃芪甲苷的含量進行測定，均取得較好的檢測效果。王麗娜等［26］利用HPLC?CAD 法同時測定了13批不同產地柴胡藥材中柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d 的含量，結果基線平穩、干擾小、峰形對稱、分離度好、準確度高，明顯優于高效液相色譜?紫外檢測法。Wang等［27］建立了同時測定人參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和Rd 含量的LC?CAD 法，并與ELSD 和UV 檢測器進行了對比，結果表明CAD 對人參皂苷的定量限和檢測限最低，線性稍好于ELSD，比ELSD 具有更好的重現性，接近于UV 的重現性。目前CAD 的應用以在皂苷類成分分析中應用最多［6］，表明CAD 在皂苷類成分分析方面的效果尤為突出［28］。

2.3 分析生物堿類化合物 生物堿是主要存在于植物體內的一類含氮的堿性有機化合物，大多具有較復雜的環狀結構，近年研究表明其具有抗腫瘤、抗菌消炎、鎮痛等生物活性［29］。部分季銨型生物堿、異甾體生物堿等無共軛結構，使用紫外檢測器無法得到滿意的檢測結果。張敏利等［30］采用CAD 檢測器直接測定了枸杞子中甜菜堿的含量，大大簡化了分析操作步驟，避免了以往紫外檢測法用于甜菜堿測定的柱前衍生化過程，且得到了比較精確的結果。廖強等［31］通過柱后補償液相色譜結合CAD 檢測器測定了浙貝母中貝母素甲和貝母素乙含量，與藥典方法進行比較，提高了重現性及響應因子的一致性，可在缺少對照品的情況下，作為貝母素甲和貝母素乙的相對測定方法。高攀等［32］使用HPLC?CAD 法同時測定了元胡止痛膠囊中4 種生物堿類成分延胡索乙素、鹽酸黃連堿、去氫延胡索甲素、延胡索甲素的含量，結果準確，為中藥復方的多成分質量控制提供了更全面的方法。

2.4 分析萜類化合物 萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物，具有抗癌、消炎、降糖等藥理作用，被廣泛應用于醫療、食品及日化等領域［33］。銀杏葉萜類內酯因其在銀杏葉中的含量很低，且紫外吸收較弱，一般的分析方法很難測定［34］。劉麗娜等［35］使用HPLC?CAD 法測定了銀杏葉提取物中白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C 4 個萜類內酯的含量，將該法檢測結果與《中國藥典》 采用的HPLC?ELSD 法進行對比，CAD 檢測器對這4 種萜類內脂的靈敏度和響應一致性均優于ELSD 檢測器。白鋼鋼等［34］建立了4 種銀杏葉制劑中萜類內酯類成分的含量測定的方法，該法重復性良好，操作簡單，具有高準確度與靈敏度，可用于銀杏葉制劑中萜類內酯類成分的含量測定。齊墩果酸和熊果酸在紫外區只有末端吸收，響應值較低且存在背景干擾，不易采用紫外檢測器進行定量分析［36］。燕霞等［37］建立了一種基于HPLC?CAD 測定女貞子藥材中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，方法學考察各項內容均符合要求，結果準確。Zhang 等［38］建立了HPLC?CAD 法測定川楝子中川楝素含量的方法，并對ELSD 與CAD 的靈敏度進行了評估和比較，結果表明CAD 法得到的川楝素的檢測限和定量限分別比ELSD 法低30 和25 倍。

2.5 分析甾體類化合物 目前，使用RP?HPLC 法可以實現對部分膽汁酸的定性和定量分析。但由于膽汁酸是一類紫外吸收較弱的固醇類化合物，使用UV 檢測靈敏度很低，目前大多采用ELSD 檢測。王一博等［39］使用HPLC?CAD 法同時測定了熊、豬、牛、羊膽粉中5 種膽汁酸的含量，并將本方法與HPLC?ELSD 法相比較，結果CAD 的靈敏度為ELSD 的3 倍，線性范圍比ELSD 高2 個數量級，并且CAD的響應因子比ELSD 更具有一致性。馬婷婷等［40］建立了HPLC?CAD 法測定蛇膽汁中牛磺膽酸鈉的含量，與UV、ELSD 進行比較，CAD 法得到的牛黃膽酸鈉的LOD、LOQ分別比ELSD 低46、40 倍，比UV 低134、116 倍。表明CAD 檢測器在甾體化合物中的測定具有明顯的優勢。

2.6 分析脂肪酸類化合物 GC 和HPLC 與不同的檢測器聯用是目前常用的檢測脂肪酸的方法，氣相色譜?氫焰離子化檢測器（Gas chromatography?flame ionization detector，GC?FID）分析脂肪酸具有準確度高、靈敏度高和操作方便等優點，GC?MS 結合了GC 的高分辨率和MS 的高靈敏度，并具有較高的定性和定量潛力。但在GC?FID 和GC?MS 測定前，均需進行脂肪酸衍生化以增加其揮發性并降低其極性，該法繁瑣而費時。采用HPLC?CAD 方法，可直接分析脂肪酸而無需衍生化反應，因此，HPLC?CAD 被認為是脂肪酸分析中最有效、最通用的技術之一。Yang 等［41］通過響應面法優化了藿香籽油的提取工藝，并建立了快速、非衍生化的HPLC ?CAD 方法用于同時測定藿香籽油中五種脂肪酸的含量。Wu 等［42］研究并開發了一種高效提取鴉膽子油的方法，并建立了HPLC?CAD 法分析了14 批不同產地的鴉膽子中5 種脂肪酸的含量，該法避免了樣品預處理的復雜性，靈敏度高、檢出限低，同時，CAD 檢測器的使用還檢出了之前從未在鴉膽子油中檢出的亞麻酸。

2.7 分析其他類化合物 趙鑫等［43］采用HPLC?MS?CAD 色譜聯用技術，對辛夷中松脂素二甲醚、木蘭脂素、里立脂素B 二甲醚和表木蘭脂素A 4 個指標性成分進行了定量分析，成功建立了基于CAD 檢測特點的辛夷藥材提取物質量控制的一測多評新方法。Wong 等［44］通過UHPLC 法與電霧式檢測器（UHPLC?CAD）相結合測定了銀黃滴丸中賦形劑聚乙二醇PEG?4000 的含量。羅昌明等［45］運用HPLC?CAD法同時測定了風濕定片中八角楓苷A、甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素的含量，其中八角楓苷A、水楊苷、甘草次酸、異歐前胡素均為首次測定，該法操作簡便、準確度高，有效地實現了風濕片的多成分質量控制。Zhang 等［46］首次采用HPLC?CAD法測定了補骨脂中13 種組分的含量，結果表明CAD 對其中大多數化合物檢測的靈敏度是DAD 的二倍。更多CAD在中藥成分分析中的應用見表2。

表2 CAD 在中藥成分分析中的應用

2.8 局限與發展趨勢 CAD 在中藥領域的應用越來越廣，而實驗過程中的一些問題也隨即暴露，如待測物需先經干燥，故難以檢測揮發性物質；該監測器基于氣溶膠方法獲得的濃度和峰面積均為非線性的，在實際計算中不如紫外檢測器方便［64］且不能像質譜探測器那樣識別某個峰或進行峰純度分析［9］；此外其響應會受流動相組成的影響，但該問題可以通過逆濃度梯度補償法來解決，即在色譜柱后進入檢測器前加入另一分析溶劑，通過增加有機相比例，可以提高霧化效率，增加響應值，降低檢出限，提高檢測效果［4］。雖然CAD 檢測器具有一定的局限性，但不失為紫外檢測器等其他檢測器的有力補充，尤其是隨著多維色譜技術的聯合應用，多種檢測器的聯用也越來越普及，UV 與CAD 檢測器的聯用可以實現大部分無紫外吸收化合物與有紫外吸收化合物的同時檢測，并能對其準確定量。此外，如今大力提倡綠色化學，乙腈作為液相色譜分析中最常用的溶劑在分離和檢測方面具有很好的物理化學性質，但從其毒性角度來看并不符合綠色化學標準。丙酮被稱為僅次于水的第二綠色溶劑，有文獻表明可在反相液相色譜?電霧式檢測器中用丙酮作為乙腈的替代品，且丙酮的相對高揮發性也符合CAD 對流動相的要求，但丙酮的紫外截止波長為330 nm，并不適用于紫外檢測器［2，65］。由此可見CAD 的局限并不會成為阻礙其發展的原因，相反隨著色譜技術的發展，CAD 能更好的適用于中藥分析領域研究中。

3 展望

中藥是中華民族智慧的結晶，要實現中藥現代化、國際化，一套被國際認可的質量控制標準是必不可少的，但中藥成分的復雜性使中藥成分分析一直存在諸多困難，需要一種高效率、高靈敏度、高重現性的分析手段來解決這些困難。近年來，CAD 檢測器的應用為中藥分析方法提供了更多的選擇，在中藥物質基礎與質量控制方面發揮著重要的作用，但總體來看，CAD 檢測器在中藥領域的應用并不廣泛，主要集中于糖類和皂苷類化合物的檢測，而對于生物堿、萜類等化合物的報道較少。且CAD 檢測器也存在一些缺陷，如其濃度和峰面積均為非線性的，在實際計算中可能不如紫外檢測器方便等。其次，使用UV 檢測器可解決絕大多數中藥化學成分的分析問題，且幾乎所有液相色譜都配有UV 檢測器，CAD 則更多作為UV 檢測器的補充。盡管如此，CAD 仍不失為一款良好的通用型檢測器，未來該檢測器可應用于更多種中藥成分的分析以及多組分的含量測定，同時也適用于指紋圖譜的建立以及提取工藝優化等方面。同時隨著中藥劑型的增多，CAD 檢測器在中藥制劑的雜質檢查與輔料評價方面也具有很大的發展潛力。CAD 檢測器在中藥領域新的應用還需要進行更深入研究，不斷的擴展，并通過改進方法規避其局限性，使中藥分析方法更加綠色科學，中藥有效成分更加明確，中藥質量控制更加規范。