參麥注射液對脂多糖誘導HUVECs 細胞損傷的影響

陳勇德，俞維英，沈志華

（紹興市中心醫院醫共體總院，浙江 紹興 312030）

隨著生活水平的提高，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）相關疾病已躍居于人口死亡的主要原因之列。動脈粥樣硬化的發病機制很復雜，一般認為其發生的機制包括自由基損傷、炎癥反應、脂質代謝紊亂等。這些機制不是獨立發揮作用的，而是相互影響，最終導致斑塊的破裂，造成嚴重心腦血管疾病。這些機制中炎癥機制是研究者普遍認可的動脈硬化機制，炎癥是機體對損傷產生的一種保護性反應，但過度的炎癥反應也可直接導致組織細胞的損傷和凋亡［1］，抗炎治療目前已經成為動脈粥樣硬化的主要治療手段［2］。

參麥注射液是紅參、麥冬的提取物，益氣固脫，養陰生津，生脈。用于治療氣陰兩虛型之休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒細胞減少癥［3?4］。有研究表明參麥注射液能調節炎癥因子的表達［5?6］，對機體細胞起保護作用，同時降低細胞黏附因子的表達［7?9］，從而影響單核細胞向內皮黏附、遷移［10］，降低細胞凋亡的發生本研究從參麥注射液參麥注射液對人臍靜脈內皮細胞相關炎癥因子及黏附因子的表達來探討其抗動脈粥樣硬化的機制［11］。

1 材料

1.1 試劑與藥物 參麥注射液，批號1712137，購自正大青春寶藥業有限公司，使用含血清培養基進行稀釋至2%、5%；Human Endothelial?SFM（Thermo，批號41966052）；Medium 199（Thermo，批號 43955451）；胎牛血清（GIBCO，N170810PA）；二甲基亞砜（Sigma，RNBJ1732）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma，089K0733）；磷烯醇丙酮酸（Aladdin，批號180752）；RIPA 細胞裂解液（南京建成生物工程研究所，批號170511）；BCA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號180107）；PVDF 膜（Millipore，批號R9AA8534）；ICAM?1 單抗（CST，批號875147）；VCAM?1 單抗（CST，批號457814）；β?actin（CST，批號854275）。

1.2 細胞株 THP?1 細胞，購自上海中國科學院細胞庫。

1.3 儀器 3111 CO2培養箱（美國Thermo 公司）；C6 plus 流式細胞儀（美國BD 公司）；Ti2?U 熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）；EPS 300 電泳儀（上海天能科技有限公司）；Tanon 4100 凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；CFX connect 熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

2.1.1 原代HUVECs 細胞培養 無菌條件下取新生兒臍帶，參照Human Endothelial?SFM（GIBCO）培養基說明，用含雙抗的Medium 199 培養基灌洗臍靜脈；灌洗后一端用止血鉗夾閉，另一端灌入含0.1% Ⅰ型膠原酶的Medium 199，待靜脈充盈后，用止血鉗夾閉灌入端。于22 ℃孵育25 min；收集靜脈中的消化液，并用50 mL Medium 199 繼續灌洗靜脈，收集灌洗液并合并。置于離心機中，常溫下100×g離心5 min，棄去上清，用50 mL Medium 199 重懸并洗滌細胞；細胞經洗滌后，用5 mL Endothelial?SFM（20 μg／mL）重懸細胞，將細胞接種至培養皿中，37 ℃、5%CO2培養箱內培養。同時觀察細胞生長情況；待細胞長至單層80%融合時，傳代培養［12］。

2.1.2 THP?1 細胞培養 細胞系采用含10% FBS、1%PEP、1%雙抗的RPMI?1640 培養基進行培養，細胞生長密度至85%～90%時，按1 ∶2 比例進行傳代。

2.2 細胞黏附測試 THP?1 細胞生長至70%～80%左右時進行慢病毒（GFP 標記）轉染，24 h 后更換培養基，繼續培養48 h。HUVECs 細胞生長至80%～90%時進行接種，細胞接種至12 孔板中繼續培養至貼壁，細胞各組除空白組外給予1μg／mL LPS 處理24 h，移去培養基后給藥組分別給予不同濃度的參麥注射液（2%、5%），繼續培養24 h 后，每孔加入GFP 標記的THP?1 細胞（2×105／孔），培養30 min后用PBS 洗去漂浮細胞，使用熒光顯微鏡觀察細胞［13?14］。

2.3 RT?PCR 檢測用TRIzol 試劑盒提取細胞總RNA。產物經First?Strand Synthesis System（Takara）試劑盒反轉錄生成cDNA，采用SYBR Green 熒光染料法進行實時定量PCR檢測各組mRNA 表達，反應體系為25 μL，各引物序列為GAPDH正向5′?CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT?3′，反向5′?GATTTTGGAGGGATCTCGCT?3′；ICAM?1 正向5′? TCTGTGT CCCCCTCAAAAGTC?3′，反向5′? GGGGTCTCTATGCCCAA CAA?3′；VCAM?1 正向5′? GCTGCTCAGATTGGAGACTCA?3′，反向5′?CGCTCAGAGGGCTGTCTATC?3′；TNF?α 正向5′?CCCGAGTGACAAGAATGTAG?3′，反向 5′?TGAGGTA CAGGCCCTCTGAT?3′；IL?6 正向 5′?AATGAGGAGACT TGCCTGGT?3′，反向5′ ?GCAGGAACTGGAT CAGGACT?3′；IL?1β 正向5′?CAGATGAAGTGC TCCTTCCA?3′，反向5′?ACCAGCATCT TCCTCAGCTT?3′。

2.4 Western blot 檢測 采用RIPA 細胞裂解液提取各組HUVECs 細胞總蛋白，用BCA 試劑盒進行蛋白定量?？偟鞍字屑尤?／4 體積的上樣緩沖液，沸水浴處理后，上樣進行10% SDS?PAGE 電泳（50 μg／孔）。電泳后進行轉膜（PVDF）并封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜。經熒光標記的二抗室溫孵育1 h 洗膜后，將膜置于凝膠成像儀上成像。以目的蛋白與β?actin 條帶光密度值之比值表示目的蛋白表達水平。

2.5 ELISA 檢測 取對數生長期的HUVECs 細胞接種于6孔板中，培養至細胞貼壁后，加入1 μg／mL LPS 孵育24 h［15］，給予含不同體積分數的參麥注射液（2%、5%）培養基繼續培養細胞，24 h 后收集細胞上清液，按ELISA試劑盒說明，檢測上清中IL?1β、TNF?α、IL?6 等炎癥因子的水平。

2.6 細胞凋亡檢測 取對數生長期的HUVECs 細胞接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，加入LPS，以含普通培養基為實驗空白組。LPS 作用24 h 后分別給予不同濃度的參麥注射液，繼續培養24 h 后，收集各組細胞，1 000 r／min 離心5 min，棄上清，用預冷的PBS重懸和洗滌細胞2 次，然后進行細胞計數。按照AnnexinV／PI 試劑盒說明書加入細胞重懸結合液190 μL，再加入10 μL PI，避光孵育5～10 min，然后用流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡情況。凋亡率＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。

2.7 統計學分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行數據分析，計量資料以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）進行統計。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 參麥注射液抑制LPS 誘導的HUVECs 細胞凋亡 空白組的凋亡率為（4.87±1.26）%，模型組的凋亡率升高至（37.86±5.61）%，2% 參麥注射液組為（25.78±3.97）%，5% 參麥注射液組為（17.34±4.15）%，呈劑量依賴性抑制HUVECs 細胞凋亡。與模型組比較，2%、5%參麥注射液凋亡率均降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 參麥注射液對脂多糖誘導的HUVECS 細胞凋亡的影響（n＝3）

3.2 參麥注射液抑制LPS 誘導的細胞黏附及相關因子表達LPS 處理HUVECs 細胞后，細胞的黏附能力增加，與空白組相比較THP?1 細胞黏附量增加，ICAM?1、VCAM?1 蛋白和mRNA 表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；給予2%、5%參麥注射液處理后，細胞的黏附能力下降，ICAM?1、VCAM?1 蛋白和mRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2～3。

圖2 參麥注射液抑制LPS 誘導的細胞黏附（n＝3）

圖3 參麥注射液對LPS 誘導的VCAM?1 和ICAM?1 表達影響（n＝6）

3.3 參麥注射液抑制LPS 誘導的炎癥因子表達 LPS 處理HUVECs 細胞后，細胞IL?1β、IL?6、TNF?α 表達增加（P＜0.01）；給予2%、5% 參麥注射液處理后，IL?1β、IL?6、TNF?α 表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

圖4 參麥注射液抑制LPS 誘導的炎癥因子（TNF?α、IL?6、IL?1β）表達（n＝6）

4 討論

炎癥是動脈粥樣硬化性疾病的基本特征，同時亦是AS的始動因子。炎癥參與了AS 的不同病理過程。在AS 發展過程中，始終有大量的炎癥因子參與其中。其中TNF?α 具有直接的促炎作用，可誘導炎癥因子的表達和釋放，促進炎性細胞的生成，導致內皮細胞功能障礙，最終促進AS的發生和發展。而IL?6 是由多種細胞分泌，能夠放大急性炎癥反應，促使機體產生慢性炎癥，并處于中心地位。炎癥因子IL?1β 可通過上調ox?LDL 及LOX?1 表達，參與死亡蛋白介導的內皮細胞損傷，促進平滑肌細胞增殖、趨化。故調整上述炎癥因子能有效緩解細胞炎癥的發生。本研究證實LPS 誘導HUVECs 細胞可導致細胞IL?6、IL?1β 和TNF?α 的蛋白和mRNA 表達明顯增高，當給予參麥注射液孵育后，這三種炎癥因子顯著下調。實驗表明參麥注射液可以通過抑制炎癥因子的表達，從而抑制細胞炎癥的發生和發展。炎癥反應的發生和發展，會進一步導致細胞細胞凋亡的發生。當給予人臍靜脈內皮細胞LPS 處理后，HUVECs 細胞凋亡率顯著增加，而給予參麥注射液后凋亡率顯著降低。說明參麥注射液能有效保護LPS 導致的細胞凋亡。

動脈粥樣硬化的發生與發展還與黏附因子密切相關，細胞黏附因子能介導細胞間的黏附，并參與細胞的信號傳導與活化、細胞的生長與分化等一系列重要生理和病理過程。在病變形成早期VCAM?1 能促進單核細胞向內皮黏附、遷移，在進展期病變，促進已遷入病灶的單核細胞滾動、T淋巴細胞的激活，并增加其它細胞與細胞間的相互作用。而在內皮細胞表達的黏附因子ICAM?1 涉及單核細胞、淋巴細胞向內皮的黏附及遷移。本研究發現LPS 可以促進內皮細胞中VCAM?1、ICAM?1 的產生，最終導致內皮細胞的黏附能力增加。而給予參麥注射液后，人臍靜脈內皮細胞對THP?1 細胞的黏附能力下降，同時黏附因子的mRNA 及蛋白表達均顯著下降。綜上所述，參麥注射液具有抑制炎癥因子表達，降低黏附因子生成，并緩解細胞凋亡發生的作用。