姜黃素通過調控脂多糖誘導的炎癥抑制軟骨細胞凋亡

李亞楠，倪 娟，方禹舜，談鴻飛，周觀金，張青松*

（1.武漢市第四醫院，華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院運動醫學科，湖北 武漢430030； 2.武漢市第四醫院，華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院血液風濕科，湖北 武漢 430030）

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是一種多因素導致的退化性肌肉骨骼疾病，軟骨細胞炎癥反應可能介導其發展［1?2］。OA 的主要病理特征為軟骨細胞減少，細胞外基質代謝紊亂，滑膜炎癥反應以及軟骨和軟骨下骨深層形態的改變［3］。據估計，全世界10%～20%人口受到OA 的影響，其發病率可能隨著壽命延長而增長［4］。OA 的病因尚未確定，軟骨細胞的異常凋亡可導致軟骨損傷從而引起OA［5］。目前，OA 的治療大多只針對臨床癥狀而非病因，僅僅緩解了疼痛，不能防治軟骨損傷和其他關節組織的破壞［4］。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的多酚物質，具有抗炎、抗氧化等藥理作用［6?7］。前期研究發現，姜黃素可緩解脂多糖誘導的軟骨細胞炎癥反應，并抑制軟骨細胞凋亡［8］，但其抑制細胞凋亡的相關機制并未進行深入探討。本研究將從線粒體功能損傷介導細胞凋亡的角度，進一步探討姜黃素抑制軟骨細胞凋亡的可能機制。

1 材料

1.1 動物 4 周齡清潔級SD 雌性大鼠5 只，體質量（150±20）g，購自三峽大學實驗動物中心［實驗動物生產許可證號SCXK（鄂）2017?0012］，適應性喂養1 周后進行實驗（實驗動物合格證號42010200002112）。

1.2 藥物與試劑 姜黃素（美國Sigma?Aldrich 公司，批號C1386?5G）；脂多糖（LPS，美國Sigma?Aldrich 公司，批號L2630?10MG）；DMEM 培養基（美國Hyclone 公司，批號SH30022.01B）；胎牛血清、II 型膠原酶（美國Gibco 公司，批號10270?106、17101015）；青?鏈霉素?兩性霉素B 溶液（三抗）、甲苯胺藍染色液、Hochest 33258 染色液、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、RIPA裂解液、兔抗B 淋巴細胞瘤?2（B?cell lymphoma?2，Bcl?2）抗體、兔抗Bcl?2 相關X 蛋白（Bcl?2 associated X protein，Bax）抗體、兔抗細胞色素c（Cytochrome c，Cyt?c）抗體、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶?3（cysteinyl aspartate specific proteinase?3，caspase?3）抗體、兔抗caspase?9 抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號 PAB180056、PAB180070、PAB180033、PAB180052、PAB180006、PAB30599、PAB30727、PAB30055、PAB30074、PAB30094）；ATP 測試盒（南京建成生物工程研究所，批號A095）；PVDF 膜、化學發光試劑（美國Millipore 公司，批號IPVH00010、WBKLS0010）。

1.3 儀器 DMIL LED 倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；CytoFLEXS 流式細胞儀（美國Beckman 公司）；MK3酶標儀（芬蘭雷勃公司）；mini protean 3 cell 電泳儀（美國Bio?Rad 公司）；Tanon?5200 全自動化學發光分析儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠軟骨原代細胞的分離 將大鼠頸椎脫臼致死，于無菌條件下取其膝關節處軟骨，使用PBS 清洗3 次。將軟骨剪成大小為1 mm3碎塊，加入0.2% II 型膠原酶，置于振蕩器上振蕩1 h。加入0.25% 胰蛋白酶消化30 min 后，終止消化。收集上清液，200 目篩網過濾，收集濾液，1 500 r／min 離心10 min，棄上清，使用含10% 胎牛血清，100 U／mL 青霉素和100 mg／L 鏈霉素的DMEM 培養基重懸細胞，離心后收集細胞，再重懸于DMEM 培養基中進行培養。每隔2 d 更換1 次培養基，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞鋪滿瓶底80% 左右時，離心收集細胞，使用新鮮培養基重懸細胞進行傳代培養。

2.2 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞 將軟骨細胞培養于放有載玻片的培養基中，培養48 h 后使用4% 甲醛進行固定。加入甲苯胺藍染液，完全覆蓋細胞染色5 min，PBS 沖洗，將細胞置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 細胞模型制備與分組處理 參考文獻［8］。取生長狀況良好的大鼠軟骨細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化制備成單細胞懸液，以1.0×105／mL 將細胞接種于24 孔板內，每孔加入2 mL 含10%胎牛血清的DMEM 培養基。將細胞分為對照組、模型組及姜黃素低、中、高劑量組，除對照組外，其他4 組細胞均采用含有5 μg／L LPS 培養基刺激1 h 構建軟骨細胞炎癥模型。姜黃素低、中、高劑量組的培養基中分別加入5、10、20 μmol／L 姜黃素干預24 h 后，進行各項指標檢測。

2.4 Hoechst 33258 染色觀察細胞形態及凋亡情況 收集上述分組處理后的細胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 清洗2 次，Hoechst 33258 染色液覆蓋細胞，室溫染色5 min，PBS 清洗5 次，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態及凋亡水平。

2.5 流式檢測細胞線粒體膜電位 收集1.0×105～5.0×105個細胞重懸于0.5 mL 細胞培養液中，加入0.5 mL JC?1 染色工作液，混勻，室溫孵育30 min。4 ℃、1 500 r／min 離心3 min，收集細胞沉淀。JC?1 染色緩沖液（1×）洗滌2次，將細胞重懸于JC?1 染色緩沖液（1×）中，4 ℃、1 500 r／min 離心3 min，收集細胞沉淀，再加入1 mL JC?1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，4 ℃、1 500 r／min 離心3 min，收集細胞沉淀。JC?1 染色緩沖液（1×）重懸，流式細胞儀檢測。

2.6 流式檢測細胞ROS 水平 稀釋DCFH?DA，使其終濃度為10 μmol／L。將細胞懸浮于DCFH?DA 中，細胞濃度為1.0×107／mL，室溫孵育30 min，每隔5 min 混勻一下，使細胞和探針充分接觸。用無血清培養液洗滌細胞3 次，收集各組細胞，流式細胞儀檢測。

2.7 ATP 測試盒測定細胞內ATP 水平 收集各組細胞，按照ATP 測試盒說明書嚴格操作，測定細胞內ATP 濃度。

2.8 Western blot 檢測凋亡相關蛋白表達水平 RIPA 裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA 法進行蛋白定量，以20 μg蛋白上樣量進行SDS?PAGE 電泳，將蛋白轉印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（Bcl?2、caspase?3、caspase?9，1 ∶2 000；Bax、Cyt?c，1 ∶1 000），室溫孵育1 h，PBS 洗滌3 次，加入經辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，PBA 洗滌3 次，滴加化學發光試劑，充分接觸后，于全自動化學發光分析儀中檢測，讀取條帶灰度值。

2.9 統計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，重復3 次，計量資料以（）表示。多組間比較使用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 軟骨細胞鑒定 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞，細胞呈貼壁生長，細胞形態不一，多呈梭形，胞漿著淺藍色，細胞核清晰呈圓形，著深藍色，見圖1。

圖1 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞

3.2 姜黃素對軟骨細胞凋亡的影響 與對照組細胞相比，模型組出現部分細胞核固縮深染，凋亡小體呈亮藍色，說明模型組部分細胞出現凋亡。中、高劑量的姜黃素干預后，凋亡小體減少，見圖2。

圖2 Hoechst 33258 染色觀察細胞凋亡水平（×200）

3.3 姜黃素對細胞線粒體膜電位的影響 與對照組比較，模型組細胞綠色熒光增強（C4 區），細胞占比增多（P＜0.05），說明模型組細胞的線粒體膜電位去極化，發生早凋的細胞增多；姜黃素低、中、高劑量組線粒體去極化細胞少于模型組（P＜0.05），且中、高劑量組效果更明顯（P＜0.05），見圖3。

圖3 流式檢測軟骨細胞線粒體膜電位變化

3.4 姜黃素對軟骨細胞ATP 濃度的影響 對照組ATP 濃度為（364.74±24.41）μmol／g prot，模型組［（148.77±20.37）μmol／g prot］ 降低（P＜0.05）；姜黃素低劑量組ATP 濃度為（214.64±18.09）μmol／g prot，中劑量組為（243.26± 13.37）μmol／g prot，高劑量組為（297.74 ±16.83）μmol／g prot，均高于模型組（P＜0.05），高劑量組ATP 濃度高于低劑量組（P＜0.05）。

3.5 姜黃素對軟骨細胞ROS 水平的影響 與對照組比較，模型組ROS 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，姜黃素低、中、高劑量組ROS 水平降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組ROS 水平降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 流式檢測軟骨細胞ROS 水平變化

3.6 姜黃素對軟骨細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組Bax、Cyt?c、caspase?3、caspase?9 蛋白表達升高（P＜0.05），Bcl?2 蛋白表達減低（P＜0.05）；與模型組相 比，姜黃素 低、中、高劑量 組 Bax、Cyt?c、caspase?3、caspase?9 蛋白表達降低，Bcl?2 蛋白表達升高，以中、高劑量組更明顯（P＜0.05），呈現出劑量依賴性。見圖5。

圖5 Western blot 檢測軟骨細胞Bax、Cyt?c、caspase?3、caspase?9 和Bcl?2 蛋白表達

4 討論

軟骨細胞作為軟骨中存在的唯一細胞類型，分散于細胞外基質中，發揮著維持軟骨結構完整性和負重功能等作用［9］。與健康軟骨相比，OA 中軟骨細胞凋亡的發生率更高，可能是關節持續機械損傷的結果，且軟骨細胞的凋亡水平與軟骨損傷的嚴重程度呈正相關［10］。軟骨細胞凋亡在OA 的發生發展中起著關鍵性作用，由于目前對OA 的治療僅對癥狀起作用，不能預防和治愈OA，因此，抑制軟骨細胞凋亡可能是調節OA 軟骨變性的有效靶點［11?12］。

細胞凋亡由復雜的信號途徑有序地觸發而引起，其中死亡受體介導的外源性途徑和線粒體控制的內源性途徑為調控細胞凋亡的主要途徑，且這兩種途徑間相互關聯［13］。Yang 等［14］研究發現線粒體功能障礙及其級聯反應誘導了OA 軟骨細胞的凋亡。在OA 的發展過程中，炎癥細胞因子進入軟骨細胞，導致線粒體膜電位降低，通透性增加釋放Cyt?c，招募caspase?9 形成復合凋亡體，再激活下游凋亡效應器caspase?3，產生一系列的酶聯激活反應，導致軟骨細胞凋亡［15?16］。Bcl?2 家族可調控線粒體膜通透性，其中促凋亡蛋白Bax 接收到凋亡信號后向線粒體轉移，促進Cyt?c 釋放，而抗凋亡蛋白Bcl?2 存在于線粒體外膜，抑制Cyt?c 的釋放［17］。當線粒體功能發生故障時，可引起一系列的代謝變化，增加ROS 的產生，減少ATP 和氧氣的消耗［18］。Shi等［19］研究也發現受損的軟骨細胞釋放出ROS 并激活炎癥因子，進而加重軟骨細胞的凋亡。

姜黃素是中藥材姜黃中主要活性成分，具有抗炎癥、抗氧化、抗分解代謝等藥理活性，在OA 中具有保護關節軟骨的作用［20］。前期研究［8］以及郭楊等［21］研究結果均證實姜黃素具有抑制OA 軟骨細胞凋亡的作用，但其具體作用機制仍需明確。袁偉等［22］認為姜黃素可能通過抑制線粒體凋亡途徑，從而減少硝普鈉誘導的大鼠軟骨細胞的凋亡。本次研究結果進一步驗證了姜黃素對軟骨細胞線粒體凋亡途徑的作用，姜黃素明顯升高了炎癥軟骨細胞的線粒體膜電位以及ATP 濃度，降低ROS 水平，并抑制Bax、Cyt?c、caspase?3、caspase?9 蛋白表達，促進Bcl?2 蛋白表達，且表現出姜黃素的劑量依賴性。

綜上所述，姜黃素可通過調控線粒體介導的內源性途徑抑制脂多糖誘導的炎癥軟骨細胞的凋亡，并改善線粒體功能故障。