王不留行對脂多糖和H2 O2誘導RAW264.7 細胞炎性反應和氧化反應的影響

袁德俊，吳康郁，黃曉冰

（廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510378）

王不留行為石竹科植物麥藍菜Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke 的干燥成熟種子，別名奶米、王不留、麥藍子、剪金子、留行子，是我國傳統常用中藥，性味苦，平，歸肝、胃經。具有活血通經，下乳消腫，利尿通淋功能，用于乳汁不下、經閉、痛經、乳癰腫痛等癥［1］。現代藥理學研究表明王不留行具有廣泛的藥理學作用，包括抗腫瘤、抗炎鎮痛、抗氧化、抑制血管生成等藥理作用［2］。

目前王不留行抗炎活性研究較少。因此開展中藥王不留行相關藥效活性研究，有助于王不留行的發展與利用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW264.7 巨噬細胞是經典體外炎癥模型，常用于研究藥物抗炎活性；過氧化氫（H2O2）可以造成細胞氧化損傷。本實驗將以LPS 刺激RAW264.7 巨噬細胞作為研究載體，通過測定相關炎性因子，探討王不留行抗炎藥效活性；以H2O2造成RAW264.7 巨噬細胞氧化損傷，探討王不留行抗氧化活性。本實驗將為王不留行抗炎抗氧化作用提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物和試劑 RPMI?1640 培養基（批號＃8113920）、胎牛血清（批號＃42A0378K）、青霉素（批號＃J160035）均購買于美國 Gibco 公司；脂多糖（LPS，批號＃019M4009V）、二甲基亞砜（DMSO，貨號D2650）為美國Sigma 公司；MTT（貨號G4000，美國Progema 公司）；PBS（貨號ST447）、一氧化氮（NO，貨號S0021S）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；小鼠TNF?α（貨號ml002095）、IL?1β（貨號 ml063132）、IL?6（貨號ml002293）、PGE2（貨號 ml037542）、COX?2（貨號ml057994）ELISA 試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；SOD（貨號A001?3?2）、CAT（貨號A007?1?1）、GSH?PX（貨號A005?1?2）、MDA（貨號A003?4?1）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。王不留行來源于嶺南中藥飲片有限公司，經廣州中醫藥大學第三附屬醫院吳康郁副主任中藥師鑒定為石竹科植物麥藍菜Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke 的干燥成熟種子。

1.2 細胞 RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞，購自American Type Culture Collection（ATCC，USA）細胞資源中心。

1.3 儀器 SW?CJ?1FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；DYS?810 型顯微鏡（上海點應光學儀器有限公司）；HH4Y 型恒溫水浴鍋（上海啟前電子科技有限公司）；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機（力康生物醫療科技控股有限公司）；DOI?50 型恒溫培養箱（上海三騰儀器有限公司）；LDZX?40BI 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；酶標儀和PCR 擴增儀（美國Thermo Scientific 公司）。

2 方法

2.1 王不留行醇提物制備 取藥材王不留行于高速中藥粉碎機中打成藥材粉末，過3 號篩（60 目篩），按1 ∶10 料液比用石油醚回流脫脂2 h，加熱蒸發至沒有石油醚味，按料液比1 ∶10 加入80%乙醇，回流提取3 次，每次2 h，將所得濾液合并，減壓濃縮至沒有醇味，冷凍干燥，即得［3］。

2.2 RPMI?1640 完全培養基配制 RPMI?1640 培養基中添加10%滅活FBS 和1%青霉素，即得。

2.3 LPS 溶液配制 稱取5 mg LPS 至量瓶中，加入PBS定容至10 mL，制成500 mg／L LPS 溶液，－20 ℃避光保存。取適量LPS 溶液，RPMI?1640 完全培養基稀釋至500 ng／mL后，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 王不留行醇提物配制 稱取100 mg 王不留行醇提物溶于1.0 mL DMSO，制得100 mg／mL 母液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，分別用RPMI?1640 完全培養基制成孔內終質量濃度為80、40、20、10 μg／mL，即得。

2.5 MTT 法測定王不留行醇提物對RAW264.7 巨噬細胞細胞活力的影響 取對數生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按照4.0×104／孔的細胞濃度接種在96 孔板中，之后放置在5% CO2、37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h。第2 天棄去原培養基，進行分組處理，正常組加入含0.1% DMSO 的完全培養基，不同濃度給藥組分別加入80、40、20、10 μg／mL含完全培養基藥液培養24 h，每組6 個復孔。次日，每孔加入20 μL MTT 溶液，置于恒溫箱中繼續培養4 h，吸棄培養液，并加入150 μL／孔DMSO 溶解，水平振蕩器搖動10 min后收集DMSO 溶液，測定490 nm 波長下的OD。

2.6 MTT 法測定H2O2對RAW264.7 巨噬細胞的細胞活力影響 取對數生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按照4.0×104／孔的細胞濃度接種在96 孔板中，之后放置在5% CO2、37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h。第2 天棄去原培養基，進行分組處理，正常組加入含0.1% DMSO 的完全培養基，其余各組分別加入不同濃度的H2O2溶液，每組6 個復孔。次日，每孔加入20 μL 的MTT 溶液，置于恒溫箱中繼續培養4 h。4 h 后吸棄培養液，并加入150 μL／孔的DMSO 溶解，水平振蕩器搖動10 min 后收集DMSO 溶液，測定490 nm 波長下的吸光度［4］。

2.7 Griess 法測定王不留行醇提物對RAW264.7 的NO 水平影響 取對數生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按照4.0×104／孔的細胞濃度接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h 后棄去原培養基，進行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養基藥液培養2 h，每組6 個復孔，2 h 后除了正常組，其余均加入500 ng／mL LPS 造模并繼續培養24 h。次日，收集各孔培養基100 μL，并依照一氧化氮檢測試劑盒說明，測定540 nm波長下OD，計算各組NO 水平。

2.8 王不留 行醇提物對TNF?α、IL?1β、IL?6 和iNOS mRNA 表達影響 取對數生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按照4.0×104／孔的細胞濃度接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h 后棄去原培養基，進行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養基藥液培養2 h，除了正常組其余各組均加入500 ng／mL LPS造模并繼續培養24 h。按照Total RNA 提取試劑盒，反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR 試劑盒說明書進行操作，測定各樣品的TNF?α、IL?1β、IL?6、iNOSmRNA 表達。RT?PCR擴增反應采用CFX 96TM Real?Time PCR Detection System 擴增儀對cDNA 進行擴增，條件為95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，40 個循環；60 ℃、60 s，40 個循環，引物序列如表1 所示。以β?actin為內參基因，計算相對表達量2－ΔΔCt：ΔCt（對照組）＝Ct（對照組目的基因）－Ct（對照組β?actin），ΔCt（正常組）＝Ct（正常組目的基因）－Ct（正常組β?actin），ΔΔCt＝ΔCt（對照組）－ΔCt（正常組），相對表達量＝2－ΔΔCt。

表1 目標基因引物序列

2.9 王不留 行醇提物對TNF?α、IL?1β、IL?6、PGE2、COX?2 表達影響 取對數生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按4.0×104／孔接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后棄去原培養基，進行分組處理，正常組和模型組加入含0.1%DMSO 的完全培養基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養基藥液培養2 h，每組6 個復孔，2 h 后除了正常組，其余各組均加入500 ng／mL LPS 培養24 h。次日，收集各孔培養基，依照ELISA 試劑盒說明測定TNF?α、IL?1β、IL?6、PGE2、COX?2 水平。

2.10 王不留行醇提物對CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平的影響 取對數生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按4.0×104／孔接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后棄去原培養基，進行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養基藥液培養24 h，每組6 個復孔，24 h 后除了正常組，其余各組均加入600 μmol／L H2O2培養4 h。4 h 后收集各孔培養基，依照試劑盒說明測定CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平。

2.11 統計學分析 分別采用Graphpad Prism 6、SPSS 23.0軟件進行制圖、統計學分析，數據以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較滿足方差齊性則用LSD 分析，不滿足方差齊性則用Dunnett T3 分析。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 王不留行醇提物對RAW264.7 巨噬細胞的細胞活力影響 如圖1 所示，10、20、40 μg／mL 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞的細胞活力具有較好的維持作用，分別達到95.73%、96.89%、92.77%；80 μg／mL 王不留行醇提物給藥組細胞活力為89.14%，但相比其余3 個較弱，因此本實驗選擇給藥劑量為10、20、40 μg／mL。結果表明，10～80 μg／mL 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞沒有毒性。

圖1 王不留行醇提物對RAW264.7細胞的細胞活力影響（n＝6）

3.2 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞TNF?α、IL?1β、IL?6 表達的影響 如圖2 所示，與正常組比較，RAW264.7細胞受到LPS 刺激后，TNF?α、IL?1β、IL?6 蛋白和mRNA表達均提高（P＜0.01）；給予王不留行醇提物干預后，TNF?α、IL?1β、IL?6 蛋白和mRNA 表達下調（P＜0.05，P＜0.01），其中40 μg／mL 王不留行醇提物給藥組下調效果最為突出，TNF?α mRNA 相對表達下降至42.46 倍，蛋白表達下降至505.00 pg／mL。

3.3 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞iNOS 和COX?2 信號通路表達影響 如圖3 所示，與正常組相比，模型組iNOSmRNA 表達及NO、COX?2、PGE2水平增 加（P＜0.01）；給予20、40 μg／mL 王不留行醇提物干預后，iNOSmRNA 表達和NO 分泌水平受到抑制（P＜0.05，P＜0.01），10、20、40 μg／mL 王不留行醇提物對RAW264.7 可抑制COX?2、PGE2表達（P＜0.01）。

圖3 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞iNOS 和COX?2 表達的影響（n＝6）

3.4 H2O2對RAW264.7 巨噬細胞的細胞活力影響 如圖4所示，不同濃度H2O2對RAW264.7 細胞活力造成不同影響，且隨著H2O2濃度增大，其對細胞的損傷越大。當H2O2濃度低于600 μmol／L 對細胞造成的損傷不顯著，濃度超過600 μmol／L 則對細胞造成過度死亡。因此本次實驗選擇600 μmol／L H2O2作為誘導RAW264.7 細胞體外氧化損傷模型的濃度藥物。

圖4 不同濃度H2O2 對RAW264.7 細胞活力影響（n＝6）

3.5 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞CAT，SOD 和GSH?PX活性和MDA 水平影響 如圖5 所示，H2O2刺激RAW264.7 巨噬細胞后，細胞CAT、SOD、GSH?PX 水平均下調，MDA 水平升高（P＜0.01）；給予王不留行醇提物干預后，細胞CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），其中40 μg／mL王不留行醇提物給藥組藥效最好，CAT 水平由6.38 U／mL漲 至17.15 U／mL，SOD 水平由1.50 U／mL 漲 至17.15 U／mL，GSH?PX 水平由11.98 漲至44.52 U／L，MDA 水平由21.10 nmol／mL 降至12.00 nmol／mL。

圖5 王不留行醇提物對RAW264.7 巨噬細胞CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平的影響（n＝6）

4 討論

采用小鼠RAW264.7 巨噬細胞作為實驗載體，探討藥物是否對細胞活性具有干擾作用。結果說明10～80 μg／mL王不留行醇提物對RAW264.7 細胞沒有細胞毒性。接著采用LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞作為體外炎癥模型，采用H2O2誘導RAW264.7 巨噬細胞作為體外氧化損傷模型，探討王不留行醇提物抗炎抗氧化活性。

腫瘤壞死因子（TNF?α）是炎癥級聯反應中最重要的因子之一，能誘發白介素1β（IL?1β），白介素6（IL?6）等炎性因子的分泌并參與組織、器官以及機體的損傷等重要的炎癥反應過程［5?6］。實驗結果顯示，給予王不留行醇提物干預后，TNF?α、IL?1β 及IL?6 mRNA 轉錄水平和蛋白表達顯著下調，表明了王不留行具有抗炎活性。進一步探討研究發現王不留行醇提物抗炎活性與其調控調控誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）和環氧化酶2（COX?2）信號通路蛋白表達有關。iNOS 和COX?2 在體內分別誘導一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）生成。過高含量NO 和PGE2引起氧化反應并損傷細胞，造成多種炎癥疾病［7?8］。因此，調控iNOS 和COX?2 表達，抑制NO 和PGE2的過度生成，可以抑制炎性反應的進程［9?11］。本實驗結果顯示，給予王不留行醇提物干預后，iNOS mRNA 水平和COX?2 表達顯著下降。實驗結果表明王不留行醇提物能夠調控iNOS 和COX?2 信號通路蛋白表達，抑制下游的TNF?α，IL?1β 及IL?6 mRNA 轉錄水平和蛋白表達，發揮抗炎活性。

過氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?PX）是機體內調控氧化應激的重要相關酶，對機體的氧化與抗氧化的平衡起著至關重要的作用［12?14］。丙二醛（MDA）為不飽和脂肪酸脂質過氧化產物，其在體內的堆積會造成細胞和組織損傷。本研究結果顯示，在給予王不留行醇提物后，細胞中CAT，SOD 和GSH?PX 活性明顯提高，同時MDA 含量顯著降低，說明王不留行醇提物具有促進抗氧化酶活性，抑制脂質過氧化反應的藥物活性。

綜上所述，本研究證明了王不留行通過抑制iNOS 和COX?2 信號通路發揮抗炎活性，以及通過促進抗氧化酶活性，恢復體內氧化與抗氧化平衡，發揮抗氧化活性。