基于網絡藥理學探究芍藥甘草湯保肝作用

李雪梅，白穎鋒，杭愛武，陸兔林，毛春芹

（南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

肝臟是人體最大的實質性器官，在參與體內物質的儲存、合成、吸收和代謝過程中起到至關重要的作用。因此，肝系疾病和肝損傷會嚴重威脅到人類的健康，而迫切找到能安全有效地阻斷或逆轉肝損傷的新療法成為醫藥學領域的重中之重。具有中國傳統文化特色的中醫藥在臨床治療過程中有著巨大的潛力，其臨床治療廣泛性及安全性更是優勢所在，在當代，具有保肝護肝作用的中藥及其復方和制劑不乏其用。

中醫辨肝損傷，以見其兩脅作痛或脅下癥瘕，口苦，胸悶，納差，身目發黃等癥狀作為診斷依據，來指導臨床遣方用藥。芍藥甘草湯作為柔肝緩急止痛的基本方，出自《傷寒雜病論·辨太陽病脈證并治》，是張仲景為治療傷寒夾虛誤汗亡陽，陽復厥愈足溫后腳攣急而設［1］，僅由白芍、甘草2 味藥配伍而成，為酸甘化陰，調肝理脾之代表方。方中白芍酸寒，入肝、脾經，功善斂肝陰以養血，調理肝脾，柔肝止痛；甘草味甘性平，善緩急止痛，能入中焦而具有補脾益氣之力。兩藥相伍，益陰斂陽，調和肝脾，緩急止痛，治療脾虛肝旺脘腹攣急作痛或因陰血不足筋脈失養之四肢攣急而致痛。近年來，芍藥甘草湯的臨床應用越來越廣泛，藥理研究也更加深入。有文獻報道稱芍藥甘草湯具有養血護肝，解毒止痛，降低轉氨酶，消除黃疸等功效［2］。嘗試構建“中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖，旨在系統完整地找出芍藥甘草湯發揮保肝作用的藥效關鍵成分和藥效部位，為更加深入地闡釋白芍?甘草藥對抗肝損傷的活性物質基礎和作用機制提供參考，為藥理研究和臨床應用提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 中藥潛在化學成分數據的整理與篩選 在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP：http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）［3］中篩選白芍、甘草的化學成分，其中包括口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug?likeness，DL）。將OB≥30%，DL≥0.18 為條件篩選出潛在化學成分。檢索日期為2019 年9 月。

1.2 預測并構建成分靶點集 在PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）［4］中搜集潛在活性成分的SMILE 結構式。通 過SwissTargetPrediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）［5］數據庫和TargetNET（http：／ ／targetnet.scbdd.com）［6］數據庫預測成分靶點。SwissTargetPrediction 數據庫以可能性（probability）TOP30為納入標準。TargetNET 數據庫篩選符合里賓斯基五規則（Lipinski’ s Rule of Five）≥50%的成分進行預測，將得到的靶點以pro ＝1 為原則納入數據，且均選擇人類數據庫（Homo sapiens）。檢索日期為2019 年9 月。

1.3 預測并構建成分靶點集 通過DisGeNET（http：／ ／www.disgenet.org／web／DisGeNET／menu／home）［7］數據庫的檢索“Liver injury”“Liver disease”“hepatic injury”等關鍵詞，篩選出疾病靶點，構建疾病靶點集。在Uniprot（http：／ ／www.uniprot.org／）［8］數據庫 中獲得 靶點的Uniprot ID，將成分預測靶點和疾病靶點進行標準化處理，并將兩者取交集，得到中藥治療疾病的潛在靶點集。檢索日期為2019 年9 月。

1.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 通過生物學信息注釋數據庫（DAVID，https：／ ／david.ncifcrf.gov／）［9］的Functional Annotation 功能對潛在靶點集進行基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析及KEGG 通路富集分析。GO 富集分析由生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cell Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3 個部分組成，三者均設置P＜0.05，且均選擇人類數據庫（Homo sapiens）。檢索日期為2019 年9 月。

1.5 構建“中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖 將整理的中藥?成分?靶點?通路?疾病的數據導入Cytoscape3.2.1 軟件中，構建網絡圖。

1.6 應用ROC 曲線評價白芍?甘草藥對的共同靶點 利用GEO 數據庫，找到與非酒精性脂肪肝相關（Non?alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的數據集，使用R 語言的limma 包作差異分析，圍繞8 個相同靶點構建受試者工作特征曲 線（Receiver Operating Characteristic Curve，ROC 曲線），以血藥濃度?時間曲 線下面積（Area Under Concentration?time Curve，AUC）評價藥對白芍?甘草藥對中對NAFLD 的治療效應和診斷價值。

2 結果

2.1 白芍?甘草藥對潛在活性成分與潛在靶點的篩選結果以OB≥30%，DL≥0.18 為條件，篩選出白芍活性成分10 個（刪除3 個無標準SMILE 格式的成分），甘草活性成分73 個，見表1～2。通過SwissTargetPrediction 數據庫和TargetNET 數據庫預測并構建成分靶點集，得到白芍潛在活性成分靶點168 個，甘草潛在活性成分靶點515 個。

表1 白芍潛在活性成分

表2 甘草潛在活性成分

續表2

2.2 白芍?甘草藥對抗肝損傷靶點的篩選結果 在DisGeNET 數據庫中篩選出疾病相關靶點共605 個（刪除重復靶點）。將芍藥、甘草預測靶點分別與疾病靶點取交集，篩除重復信息，得到芍藥?甘草藥對與肝損傷疾病相關的靶點共77 個，其中白芍34 個，甘草72 個。

2.3 GO 富集分析與KEGG 通路富集分析 GO 富集分析結果顯示，BP 分析結果222 個，包括凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化的正調控、類固醇激素介導的信號通路、細胞對缺氧的反應、內皮細胞增殖的正向調控、血管生成、炎癥反應、藥物反應、積極調控細胞增殖等作用途徑；CC分析結果21 個，主要是包含膜筏、磷脂酰肌醇3?激酶復合物、細胞器膜、質膜、細胞外空間、蛋白質細胞外基質、膜、內質網膜、胞液等；MF 分析結果66 個，包括配體激活的序列特異性DNA 結合、酶結合、類固醇激素受體活性、磷脂酰肌醇3?激酶活性、1?磷脂酰肌醇?4?磷酸3?激酶活性、轉錄因子結合、磷脂酰肌醇?4，5?雙磷酸3?激酶活性、藥物結合、血紅素結合等分子途徑。

KEGG 通路富集分析得到85 條結果，篩選得到41 條通路與抗肝損傷有關，包括腎素?血管緊張素系統（ReninAngiotensin System，RAS）信號通路、缺氧誘導因子?1（hypoxia?inducible factor?1，HIF?1）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、血管內皮生子因子（Vascular Endothelial Cell Growth Factor，VEGF）信號通路、破骨細胞分化、RAS 相關蛋白1（RAS?related protein 1，RAP1）信號通路、磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）／蛋白激酶B（AKT）信號通路、胰島素抵抗、細胞凋亡、Fc epsilon RI 信號通路、B 細胞受體信號通路、乙肝和NAFLD 等。

將GO 富集分析與KEGG 富集分析結果按P 值升序排列，使用R 語言將結果TOP15 分別繪制成氣泡圖，其中氣泡越大表示涉及靶點越多，顏色由藍漸變至紅表示與研究目的呈顯著性升高態勢。見圖1。

圖1 BP、CC、MF 及KEGG 富集分析結果（前15）

2.4 繪制“中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖 將KEGG通路分析的結果整理出來，導入Cytoscape3.2.1 軟件繪制“中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖（圖2），包括中藥2個，成分77 個，靶點48 個，通路41 條，疾病1 個。根據自由度（Degree）由高到低篩選核心中藥成分，包括（E）?1?（2，4?dihydroxyphenyl）?3?（2，2?dimethylchromen?6?yl）prop?2?en?1?one、Licoagroisoflavone（甘草異黃 酮）、glypallichalcone（刺甘草 查耳酮）、1?methoxyphaseollidin（1?甲氧基 菜豆素）、shinpterocarpin、licochalcone B（甘草查耳酮 B）、8?（6?hydroxy?2?benzofuranyl）?2，2?dimethyl?5?chromenol、glabrone（光果甘草酮）、licoisoflavanone（甘草異黃烷酮）、licoisoflavone B（甘草異黃酮B）、kaempferol（山柰酚）、（3S，5R，8R，9R，10S，14S）?3，17?dihydroxy?4，4，8，10，14?pentamethyl?2，3，5，6，7，9?hexahydro?1H?cyclopenta ［a］phenanthrene?15，16?dione、jaranol（梔子醇）、quercetin（槲皮素）、odoratin（芳香膜菊素）、licoagrocarpin、gadelaidic acid（反9?甘碳烯酸）、icos?5?enoic acid、quercetin der.、isoglycyrol（異甘草酚）、eurycarpin A（黃甘草異黃酮A）、（E）?3? ［3，4?dihydroxy?5?（3?methylbut?2?enyl）phenyl］ ?1?（2，4?dihydroxyphenyl）prop?2?en?1?one、2?（3，4?dihydroxyphenyl）?5，7?dihydroxy?6?（3?methylbut?2?enyl）chromone、Gancaonin B（甘草寧B）、isotrifoliol、glyasperin F（粗毛甘草素F）、（2S）?2? ［4?hydroxy?3?（3?methylbut?2?enyl）phenyl］ ?8，8?dimethyl?2，3?dihydropyrano［2，3?f］ chromen?4?one、lupiwighteone（黃羽扇豆魏特酮）、medicarpin（美迪紫檀素）、calycosin（毛異黃 酮）、xambioona、glyzaglabrin（光甘草輪）、licoisoflavone（甘草異黃酮）、5，7?dihydroxy?3?（4?methoxyphenyl）?8?（3?methylbut?2?enyl）chromone、3?（3，4?dihydroxyphenyl）?5，7?dihydroxy?8?（3?methylbut?2?enyl）chromone、gancaonin A（甘草寧A）、licochalcone G（甘草查耳酮G）、glepidotin A（鱗葉甘草素A）、semilicoisoflavone B、sitosterol（谷甾醇）、isorhamnetin（異鼠李素）、β?sitosterol（β?谷甾醇）、phaseol、gancaonin H（甘草寧H）、gancaonin G（甘草寧G）、7?acetoxy?2?methylisoflavone（7?乙酰氧 基?2?甲基異 黃酮）、HMO、isolicoflavonol（異甘草黃酮醇）、licoricone（甘草利酮）、7?methoxy?2?methyl isoflavone、glycyrol（甘草酚）、inermine、licochalcone a（甘草查耳酮 A）、formononetin（刺芒柄花素）、paeoniflorin（芍藥苷）等。

圖2 白芍?甘草藥對抗肝損傷的“中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖

網絡圖48 個靶點中，包括白芍15 個，甘草41 個，其中有8 個相同靶點，即CYP1A2、PIM1、PPARG、PTGS2、SYK 以及基質金屬蛋白酶家族MMP9、MMP1、MMP2。為了更清晰地分析白芍?甘草藥對的協同作用，將圍繞以上8個相同靶點再次構建“中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖（圖3）。增強對芍藥甘草湯保肝作用的微觀整體認識。所構建的8 個靶點網絡分析圖顯示，靶蛋白CYP1A2 的作用通路包括類固醇激素合成和藥物代謝?細胞色素P450（drug metabolism cytochrome p450），PPARG 的作用 通路包 括PPAR 信號通路、破骨細胞分化和AMPK 信號通路，PIM1的作用通路是Jak?STAT 信號通路，PTGS2 的作用通路是脂解脂肪細胞的調節，SYK 的作用通路包括自然殺傷細胞介導的細胞毒性、NF?κB 信號通路、血小板活化、破骨細胞分化、PI3K?Akt 信號通路、FcγR 介導的吞噬作用、B 細胞受體信號通路、FcepsilonRI 信號通路、花生四烯酸代謝、VEGF 信號通路和TNF 信號通路，MMP1 的作用通路包括PPAR 信號通路，MMP2 的作用通路包括白細胞跨內皮遷移，MMP9 的作用通路包括TNF 信號通路、乙型肝炎和白細胞跨內皮遷移。

圖3 “中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖

2.5 ROC 曲線評價結果 在GEO 數據庫中篩選得到符合條件的GSE37031 數據集［10］，將白芍、甘草的相同靶點輸入驗證集進行驗證，并繪制ROC 曲線（圖4）。AUC 分數在0.50～1 之間具有預測價值，0.70 以上說明診斷價值良好，0.90 以上說明診斷價值較高。如圖所示，CYP1A2、PIM1、PTGS2、MMP9 的AUC 分數均處于0.70 以上，其中CYP1A2 和PTGS2 的AUC 分數超過0.9，表示在NAFLD 進程中，其診斷價值較高，且與健康對照組比較，疾病組的CYP1A2 和PTGS2 的表達具有顯著差異（P＜0.05），其他相同靶點的表達不顯著。

圖4 ROC 曲線圖

3 討論

關于芍藥甘草湯的藥理研究及臨床應用多集中于消化系統、內分泌系統、呼吸系統、神經系統和腫瘤癌癥等疾病，近些年研究顯示其還具有保肝作用。目前，該方針對保肝作用的藥理實驗僅為研究其有效組群芍甘多苷（含芍藥總苷、甘草酸和總黃酮苷）的保護急性肝損傷作用［11］，或白芍和甘草單味藥的有效成分保肝機理研究較多，但是關于芍藥甘草湯整體保肝作用機制尚未有系統完整地挖掘分析，同時對白芍?甘草藥對的其他化學成分和作用機制也鮮有報道。但因白芍?甘草藥對配伍后其活性成分含量存在改變，且部分活性成分使用效用顯著增強，如甘草可以促進芍藥中芍藥苷的吸收，芍藥可提前助燃甘草中甘草次酸在體內出現的時間和數量［12?14］，所以本項研究通過篩選白芍?甘草藥對中治療肝損傷的活性成分，獲取靶點，構建網絡圖，利用GO 及KEGG 分析其生物過程及信號通路，系統闡釋了其具有保肝作用的活性成分和作用機制。

3.1 白芍?甘草藥對存在多種潛在成分對肝損傷有抑制作用 通過研究發現，白芍?甘草藥對治療肝損傷的活性成分中主要包括甘草黃酮類化合物如甘草查耳酮A、毛異黃酮，以及山奈酚、槲皮素、異鼠李素、芍藥苷、β?谷甾醇、刺芒柄花素和甘草酸及其衍生物等。最后篩選整理得到的成分中包括了大部分已被實驗驗證具有保肝作用有效成分，表明了研究數據的合理性。文獻報道顯示，白芍總苷有抗炎、鎮痛，保肝等藥理作用［15?16］。其中芍藥苷對不同種類型肝損傷均有保護作用，例如通過NAFLD 及其多種信號途徑來抑制肝膽固醇的脂質合成，可以保護肝臟抗氧化、抗炎、抗凋亡［17?20］。甘草黃酮類化合物、甘草酸及其衍生物對多種肝損傷有保護作用［21?26］。

與此同時，還存在多種潛在成分跟上述成分共同構成了白芍－甘草藥對的抗肝損傷作用的物質基礎，如山奈酚可減輕肝纖維化，具有抗氧化和保肝活性［25，27］。槲皮素是一種生物類黃酮，通過調控PI3K／Akt／NF?κB 信號通路來改善NAFLD 的肝組織脂肪變性程度，減輕肝臟炎癥［28?29］。植物甾醇可抑制肝臟內膽固醇的生物合成和阻斷致癌物誘發癌細胞形成等功能，有研究顯示，β?谷甾醇能夠提高免疫功能且具有一定抗腫瘤作用，可緩解DMN 誘導的肝臟損傷，防止膠原蛋白的積聚［30?31］。異鼠李素可抑制肝星狀細胞活化，細胞外基質沉積和自噬，具有抑制肝纖維化的作用［32］。刺芒柄花素通過減少脂質過氧化作用，減少肝損傷并恢復肝細胞谷胱甘肽起到保護肝細胞的作用［33］。

3.2 白芍?甘草藥對中重要潛在靶蛋白通過炎癥通路、信號轉導通路和其他相關通路對肝損傷有保護作用 根據篩選得到芍藥甘草湯與肝損傷相關的活性靶點有48 個，其中包括白芍?甘草藥對的相同靶點8 個，即CYP1A2、PIM1、PPARG、PTGS2、SYK 和基質 金屬蛋 白酶家 族MMP9、MMP1、MMP2。圍繞其相同靶點構建的“中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖（圖3）含88 個點，204 條邊，表示這8 個靶點可視為白芍?甘草藥對作為發揮藥效的重要潛在靶點。以NAFLD 為例，ROC 曲線評價結果顯示，靶蛋白CYP1A2 和PTGS2 具有顯著意義。靶蛋白CYP1A2 的作用通路包括類固醇激素合成和藥物代謝?細胞色素P450，藥物代謝?細胞色素P450 中存在負責代謝異生物的酶，有研究表明，CYP 基因參與肝臟的異種生物和藥物代謝，且其中的CYP1A2 可以在肝細胞中參與多種外來化合物及藥物代謝［34?36］。PTGS2 具有抗氧化和抗炎作用，有助于改善肝損傷［37］，提示白芍?甘草藥對配伍可能發揮協同作用，一方面調節CYP1A2 的轉錄，改變其活性，促進藥物代謝，另一方面通過靶蛋白PTGS2 調節脂解脂肪細胞，在NAFLD 進程中有保護肝臟的作用。另外，靶蛋白SYK 的作用通路包括PI3K?Akt 信號通路、VEGF 信號通路、花生四烯酸代謝和TNF 信號通路等。PI3K?Akt 信號通路是參與細胞代謝、生長、凋亡和增殖的重要節點，能被多種類型的細胞刺激或毒性刺激所激活，蛋白一旦激活，Akt 即可通過磷酸化介導生長因子促增殖、抗凋亡發揮抗肝損傷作用［38?41］；VEGF又稱血管滲透因子，其表達與肝纖維化和肝內血管增生有關［42?43］；花生四烯酸代謝物作為脂類介質在調節肝臟的生理和病理過程中起著重要作用，與其他致炎因子如自由基、TNF、IL?1 等共同介導肝損傷，通過干擾花生四烯酸可能對肝損有重要作用［44?48］。在基質金屬蛋白酶家族有關的通路中，肝臟選擇性MMP?9 抑制可防止肝臟VEGF 的蛋白分解，具有改善損傷，加速肝臟的再生的作用［49］，MMP9 的作用通路還包括白細胞跨內皮遷移通路，該通路與肝臟血管內發生缺血?再灌注損傷關系密切［50］。

結合“中藥?成分?靶點?通路?疾病”網絡圖（圖2）與KEGG 的分析結果顯示，白芍?甘草藥對的其他信號通路可能也是其發揮保肝作用的重要途徑。包括Ras 信號通路、HIF?1 信號通路、Rap1 信號通路、胰島素抵抗、細胞凋亡和NAFLD 等。RAS 的失衡與肝損傷的發生發展密切相關，通過調節Ras 信號通路的相關信號分子，可以抑制肝星狀細胞活化和抗肝纖維化，通過阻斷肝臟中RAS 對改善血脂狀況和限制NAFLD 的進展具有潛在意義，可以改善胰島素信號傳導和調節脂肪細胞的增殖，對高脂飲食誘導的肝損傷具有保護作用［51?53］；缺氧是誘導肝臟局部炎癥和血管生成的主要因子，可引起的相關炎癥反應和纖維化，HIF?1 與VEGF 的表達在抗氧化和促進血管新生中發揮重要作用［54］；RAP1 是人肝細胞癌的一個重要的原癌基因，與細胞增殖、克隆形成和侵襲有關，肝細胞中眼缺失蛋白同源物4（eyes absent homolog 4，EYA4）通過抑制RAP1 反式激活可實現抗腫瘤作用，另外，通過抑制Rap1b 在肝細胞中的表達，可抑制氧化應激后肝細胞ERK 通路激活，熱休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，HSP70）的細胞保護作用以及肝細胞的抗氧化能力［55］。綜上所述，白芍?甘草藥對保肝作用與多條通路相關，如炎癥通路、信號轉導通路和其他相關通路，且這些通路是目前研究抗肝損傷的重要通路。

4 結論

通過網絡藥理學的方法，對芍藥甘草湯具有保肝作用的潛在活性成分、靶點、作用通路及其機制有了更深一步的認識。研究結果顯示，白芍?甘草藥對發揮藥效主要通過調節多種炎性因子，發揮抗炎、抗氧化作用，或者通過多種代謝途徑，降低肝臟內的脂質水平，或者通過抑制細胞增殖和活化，達到保護肝臟的作用。藥對的主要活性成分包括甘草黃酮類化合物如甘草查耳酮A、毛異黃酮，以及山奈酚、槲皮素、異鼠李素、芍藥苷、β?谷甾醇、刺芒柄花素和甘草酸及其衍生物等，可能依靠CYP1A2、PTGS2、SYK 和基質金屬蛋白酶家族MMP9、MMP1、MMP2 等靶蛋白，單獨、相互或共同干預Ras 信號通路、HIF?1 信號通路、TNF 信號通路、VEGF 信號通路、Rap1 信號通路、Pl3k?akt 信號通路、胰島素抵抗、細胞凋亡和NAFLD 等。另外，根據ROC 分析結果顯示，白芍?甘草藥對共同靶蛋白CYP1A2 和PTGS2 對NAFLD 具有較好的治療效應和診斷價值，其作用途徑與類固醇激素合成、藥物代謝?細胞色素P450 和脂解脂肪細胞的調節密切相關。

本研究利用網絡藥理學方法探索了中藥復方多成分、多靶點、多環節和多途徑的作用特點，日前尚未能對芍藥甘草湯抗肝損傷的主要靶點和通路及作用機制進行實驗驗證，有待后續進一步深入研究。