喉咽清口服液抗炎活性成分的篩選

歐陽(yáng)文 羅懿釩 ＃唐代鳳王雄龍張?jiān)评ぶ苋A榮于煒民曾穎陳韜劉梓琛胡云舒唐 琴陳 林郭麗娟唐純玉*李順祥*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208； 2.湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410208； 3.湖南時(shí)代陽(yáng)光博士后科研流動(dòng)站協(xié)作研發(fā)中心，湖南 永州410116； 4.湖南時(shí)代陽(yáng)光藥業(yè)股份有限公司，湖南 永州410116； 5.湖南省抗感染中藥工程技術(shù)研究中心，湖南 永州410116； 6.湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

喉咽清口服液來(lái)源于民間驗(yàn)方，由土牛膝、馬蘭草、天名精、車(chē)前草4 味藥材組成，具有清熱解毒、利咽止痛的功效，主要用于肺胃實(shí)熱所導(dǎo)致的咽部腫痛、發(fā)熱、口渴、便秘、扁桃體炎、咽炎等癥狀［1］，為湖南時(shí)代陽(yáng)光藥業(yè)股份有限公司自主研制開(kāi)發(fā)的國(guó)家級(jí)新藥。孫建輝等［2］采用滴鼻感染甲型H1N1 流感病毒FM1 株建立小鼠流感病毒肺炎模型，發(fā)現(xiàn)喉咽清口服液高、中、低劑量組（15.60、7.80、3.90 g／kg）小鼠體質(zhì)量明顯高于模型組，并且高、中劑量組存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，高劑量組肺指數(shù)值、死亡率明顯降低，在感染第6、9 天高劑量組肺組織病毒載量明顯降低，表明該制劑對(duì)甲型流感病毒性肺炎具有一定治療作用。在新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）的治療過(guò)程中，喉咽清口服液（顆粒）于2020 年2 月7 日被湖南省衛(wèi)生健康委納入《湖南省兒童新型冠狀病毒感染臨床診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)（試行第一版）》，用于兒童新型冠狀病毒感染的防治，適于咽痛偏于風(fēng)熱者［3］。

炎癥風(fēng)暴又稱(chēng)細(xì)胞因子風(fēng)暴，是指機(jī)體感染微生物后引起體液中多種細(xì)胞因子［如腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、白細(xì)胞介素?1（IL?1）、白細(xì)胞介素?6（IL?6）、環(huán)氧化酶?2（COX?2）、NO 等］ 迅速大量產(chǎn)生的現(xiàn)象，促使免疫系統(tǒng)對(duì)人體進(jìn)行猛烈攻擊，引起急性呼吸窘迫綜合征和多臟器衰竭［4］。在COVID?19、埃博拉病毒、SARS 等傳染性疾病中，炎癥風(fēng)暴是輕中癥患者向重癥或危重癥轉(zhuǎn)換的節(jié)點(diǎn)，同時(shí)也是患者死亡的原因之一，故阻斷炎癥風(fēng)暴因子發(fā)生、抑制過(guò)多免疫細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生是重要的治療手段。

臨床上利用糖皮質(zhì)激素（如地塞米松等）可非特異性抑制急性呼吸窘迫綜合征炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)來(lái)治療COVID?19，但其不良反應(yīng)（如二重感染、糖尿病、骨質(zhì)疏松、高血壓、骨壞死［5］等）較大，長(zhǎng)期使用時(shí)更明顯。當(dāng)前，以清肺排毒湯等方劑為代表的中藥全程參與了相關(guān)治療，可明顯改善癥狀，對(duì)于輕癥可縮短病程，提高治愈率；對(duì)于重癥能防止病情進(jìn)一步發(fā)展，促進(jìn)其恢復(fù)，其機(jī)制可能不是直接消滅病毒，而是通過(guò)抑制活化細(xì)胞因子、緩和過(guò)激免疫反應(yīng)、消除炎癥來(lái)達(dá)到作用［6?7］。

LPS 刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7 后，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種相關(guān)介質(zhì)和細(xì)胞因子（如NO、TNF?α、IL?6等），從而形成炎癥細(xì)胞模型，被廣泛應(yīng)用于抗炎藥物的篩選和評(píng)價(jià)。NO 作為炎癥介質(zhì)主要因子之一，在調(diào)節(jié)多種生理功能方面起到重要作用，如血管擴(kuò)張、神經(jīng)傳遞、炎癥應(yīng)答等，其釋放量可用于評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱程度［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立LPS 刺激的RAW264.7 炎癥模型，通過(guò)測(cè)定NO 釋放量分析喉咽清口服液的抗炎作用，并在此基礎(chǔ)上篩選主要活性成分。

1 材料

1.1 藥物 喉咽清口服液（批號(hào)20171108、20180705、20190716）、成型前喉咽清浸膏（批號(hào)20190716）由湖南時(shí)代陽(yáng)光藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 試劑 小鼠單核巨噬細(xì)胞株（RAW264.7）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。竹節(jié)參皂苷Ⅳa（PS010730）、竹節(jié)參皂苷Ⅴ（PS010731）對(duì)照品購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司，純度均大于98%。LPS、地塞米松、二甲基亞砜、MTT（美國(guó)Sigma 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（FBS，德國(guó)Pan Seratech 公司）；PBS 磷酸鹽緩沖液（美國(guó)HyClone 公司）；NO 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。ODS?AQ（50 μm，日本YMC公司）；色譜純乙腈、甲醇（德國(guó)Merck 公司）；分析純甲醇（湖南匯虹試劑有限公司）。

1.3 儀器 AL104 電子天平（萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；C18色譜柱（日本YMC 公司）；高效液相色譜儀，配置LC?20A 二元高壓梯度儀、SPD?20A 紫外檢測(cè)儀（日本島津公司）；Ulimate 3000／TSQ ENDURA 液質(zhì)聯(lián)用儀、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；R204B3 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州艾克林凈化設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；低速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［9?10］ 報(bào)道，將RAW264.7 細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶后加到含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分吹打混勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每天更換1 次培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。另外，還包括細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存、細(xì)胞復(fù)蘇等基本操作。

2.2 樣品制備與單體結(jié)構(gòu)分析 將喉咽清浸膏經(jīng)ODS?AQ反相柱分離后，分別用水、10% 甲醇、30% 甲醇、50% 甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇、異丙醇進(jìn)行洗脫，60 ℃下減壓濃縮后冷凍干燥，得到相應(yīng)洗脫部位，精密稱(chēng)取適量，DMSO（終體積不得超過(guò)0.1%）完全溶解，完全培養(yǎng)基配制成25、50、100、200、400、800、1 200 μg／mL 稀釋液（現(xiàn)配現(xiàn)用），0.22 μm 微孔濾膜除菌，采用LC?MS 法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并結(jié)合對(duì)照品比對(duì)。LC 分析條件為Weltch Ultimate C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～1.5 min，40%A；1.5～8 min，40%～95% A；8～9.5 min，95% A；9.5～10 min，95%～40% A；10～12 min，40% A）；體積流 量0.2 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。MS 分析條件為ESI－離子化模式；噴霧電壓3 500 V；鞘氣20 Arb；輔助氣為10 Arb；離子傳輸管溫度350 ℃；蒸發(fā)溫度350 ℃；全掃描模式MS SCAN，掃描范圍m／z100～1 000。在進(jìn)行單體抗炎活性實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別精密稱(chēng)取所鑒定成分，DMSO（終體積分?jǐn)?shù)不得超過(guò)0.1%）完全溶解，完全培養(yǎng)基配制成3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol／L 稀釋液（現(xiàn)配現(xiàn)用），0.22 μm 微孔濾膜除菌。

2.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)（MTT 法）稱(chēng)取25 mg MTT 于10 mL離心管中，加5 mL PBS 緩沖液配制成5 mg／mL 溶液，0.22 μm微孔濾膜除菌，4 ℃下避光保存，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞，脫壁后用含10%滅活胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液，以3×104個(gè)／孔、每孔100 μL 接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置空白組、對(duì)照組、樣品組，其中空白組無(wú)細(xì)胞，對(duì)照組加入含100 μL 細(xì)胞的DMEM 培養(yǎng)基，樣品組加入不同濃度樣品（不同溶劑洗脫物、單體成分），使終體積為100 μL（共7 組），每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，再加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，在培養(yǎng)板平臺(tái)振蕩機(jī)上振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為存活率＝ ［（樣品組OD值－空白組OD值）／（對(duì)照組OD值－空白組OD值）］ ×100%。

2.4 NO 釋放量檢測(cè)（試劑盒法）取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞，脫壁后用含10%滅活胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×104／mL，均勻接種于96 孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，設(shè)置正常組、模型組、樣品組，其中正常組不加LPS 和樣品；模型組在培養(yǎng)液中加入LPS 溶液（1 μg／mL）；樣品組為加入不同溶劑洗脫物、單體成分的100 μL 稀釋培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后取上清液于離心管中。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法，將各試劑依次加入培養(yǎng)基中，酶標(biāo)儀550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)NO 釋放量。

2.5 抗炎活性成分含量測(cè)定（RP?HPLC 法）

2.5.1 色譜條件 YMC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈?0.5%磷酸（33 ∶67）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

2.5.2 溶液制備

2.5.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取竹節(jié)參皂苷Ⅳa 對(duì)照品3.0 mg，流動(dòng)相溶解定容于10 mL 量瓶中，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得（0.3 mg／mL）。

2.5.2.2 供試品溶液 將口服液充分搖勻后精密吸取2 mL，置于10 mL 量瓶中，“2.5.1”項(xiàng)下流動(dòng)相超聲定容，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.5.3 方法學(xué)考察

2.5.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取竹節(jié)參皂苷Ⅳa 對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8、10 μL，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸。

2.5.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取竹節(jié)參皂苷Ⅳa 對(duì)照品溶液5 μL，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算峰面積。

2.5.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份口服液（批號(hào)20190716）6 份，按“2.5.2.2”項(xiàng)下方 法制備 供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算峰面積。

2.5.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份口服液（批號(hào)為20180705），按“2.5.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積。

2.5.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取各成分含量已知的口服液0.5 mL，加入等量對(duì)照品溶液，流動(dòng)相定容于5 mL量瓶中，微孔濾膜過(guò)濾，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL 測(cè)定，計(jì)算回收率。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LPS 質(zhì)量濃度篩選 表1 顯示，不同質(zhì)量濃度LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌的NO 均具有促進(jìn)作用，并呈劑量依賴(lài)性；作用24 h 后，0.01～1 μg／mL LPS 對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，而在10 μg／mL 下細(xì)胞 存活率下降（P＜0.05），100 μg／mL下更明顯（P＜0.01）。為了能最大限度刺激RAW264.7 細(xì)胞釋放NO，并不影響其存活率，本實(shí)驗(yàn)采用1 μg／mL LPS 質(zhì)量濃度。

表1 不同LPS 質(zhì)量濃度下的NO 釋放量和細(xì)胞存活率（， n＝3）

表1 不同LPS 質(zhì)量濃度下的NO 釋放量和細(xì)胞存活率（， n＝3）

注：與空白組（0 μg／mL）比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 洗脫部位質(zhì)量濃度篩選 表2 顯示，洗脫部位質(zhì)量濃度為400～1 200 μg／mL 時(shí)各部位細(xì)胞均有不同程度的死亡，低于200 μg／mL 時(shí)細(xì)胞存活率較高，即無(wú)明顯細(xì)胞毒性。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇6.25、12.5、25、50、100、200 μg／mL進(jìn)行下一步研究。

表2 不同洗脫部位質(zhì)量濃度下的細(xì)胞存活率（， n＝3）

表2 不同洗脫部位質(zhì)量濃度下的細(xì)胞存活率（， n＝3）

注：與空白組（0 μg／mL）比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 各洗脫部位對(duì)NO 釋放量的影響 表3 顯示，與模型組比較，各洗脫部位組均呈劑量依賴(lài)性地降低NO 釋放量，以70%甲醇部位體外抑制作用最強(qiáng)，IC50為35.25 μg／mL，是最佳活性部位。

表3 各洗脫部位對(duì)NO 釋放量的影響（， n＝3）

表3 各洗脫部位對(duì)NO 釋放量的影響（， n＝3）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 成分分析與鑒定 圖1 顯示，70%甲醇洗脫部位中有2 個(gè)主要色譜峰經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用色譜分析，峰1、2 在總離子圖中的保留時(shí)間分別為2.80、4.58 min，準(zhǔn)分子離子峰［M?H］－m／z分別為955.38、793.30。結(jié)合對(duì)照品比對(duì)，鑒定兩者分別為竹節(jié)參皂苷Ⅴ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa。

圖1 70%甲醇洗脫部位RP?HPLC 色譜圖

3.5 各成分活性研究 地塞米松為常用激素類(lèi)抗炎藥物，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為陽(yáng)性對(duì)照，分析竹節(jié)參皂苷Ⅴ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 的體外細(xì)胞毒性和抗炎活性，結(jié)果見(jiàn)表4～5。由表4 可知，各成分濃度在3.13～50 μmol／L 時(shí)均對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，而在100～200 μmol／L 時(shí)細(xì)胞均有不同程度地死亡，故選擇3.13、6.25、12.5、25、50 μmol／L 作為檢測(cè)濃度。由表5 可知，與模型組比較各成分濃度在3.13～50 μmol／L時(shí)均可呈劑量依賴(lài)性抑制NO 釋放，以地塞米松作用最強(qiáng)；相對(duì)竹節(jié)參皂苷Ⅴ，竹節(jié)參皂苷Ⅳa 活性更強(qiáng)。

表4 各成分細(xì)胞存活率（， n＝3）

表4 各成分細(xì)胞存活率（， n＝3）

注：與空白組（0 μg／mL）比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表5 各成分對(duì)NO 釋放量的影響（， n＝3）

表5 各成分對(duì)NO 釋放量的影響（， n＝3）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

3.6 方法學(xué)考察 竹節(jié)參皂苷Ⅳa 與相鄰峰可基線分離（分離度大于1.5），在相同保留時(shí)間內(nèi)空白無(wú)干擾（圖2）；該成分回歸方程為Y＝359 972X－20 210（R2＝0.999 6），在0.15～3.0 μg 范圍內(nèi)線性良好（R2＝0.999 6）；精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)中，該成分峰面積RSD 分別為1.15%、1.48%、1.09%，表明儀器精密度、方法穩(wěn)定性理想，溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 竹節(jié)參皂苷Ⅳa 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

圖2 竹節(jié)參皂苷Ⅳa RP?HPLC 色譜圖

3.7 樣品含量測(cè)定 取3 批口服液，按“2.5.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表7，可知均超過(guò)了0.2 mg／mL。

表7 竹節(jié)參皂苷Ⅳa 含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

喉咽清口服液臨床療效顯著，市場(chǎng)銷(xiāo)售良好，前期已證實(shí)該制劑對(duì)甲型流感病毒性肺炎具有治療作用［2］，而本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察該制劑總浸膏和單體成分的抗炎活性。先采用1 μg／mL LPS 建立RAW264.7 炎癥細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)模型組NO 釋放量明顯高于正常組，表明造模成功，再經(jīng)ODS?AQ 反相柱分離總浸膏，用不同溶劑進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示各洗脫組分均可劑量依賴(lài)性地降低NO 釋放量，以70%甲醇組分作用最強(qiáng)。

在2015 年版《中國(guó)藥典》 喉咽清口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，樣品水解后石油醚萃取，薄層層析分離，再通過(guò)薄層色譜掃描法測(cè)定水解產(chǎn)物中齊墩果酸含量［11］，但其準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、精密度都不理想，并且通過(guò)水解方式所得到的該成分是多種皂苷的苷元，而不是單一成分，故無(wú)法全面控制該制劑質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用LC?MS 定性鑒定結(jié)合RP?HPLC 定量分析，發(fā)現(xiàn)主要活性成分為竹節(jié)參皂苷Ⅴ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa，以后者含量更高，活性更好。另外，RP?HPLC法具有樣品處理簡(jiǎn)便，線性關(guān)系、重復(fù)性、儀器精密性良好的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)該方法測(cè)得竹節(jié)參皂苷Ⅳa 平均含量大于0.2 mg／mL，表明可通過(guò)分析該成分來(lái)控制喉咽清口服液的質(zhì)量。