薄層色譜法快速鑒別廣陳皮與陳皮

巢穎欣，劉夢詩，楊秀娟，楊得坡，陳柏忠，蔡 軼，陶移文，鄭國棟*

（1.廣州醫科大學藥學院，廣東 廣州511436； 2.中山大學藥學院，廣東 廣州510006； 3.廣東新寶堂生物科技有限公司，廣東 江門 529000）

陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮［1］，是我國傳統的“藥食同源”中藥之一，含有豐富的黃酮類、揮發油成分及少量生物堿、酚酸等成分［2?5］，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效［6］。據2015 年版《中國藥典》記載，陳皮藥材主要分為陳皮與廣陳皮［1］，其中廣陳皮主要來源于廣東、廣西兩省的茶枝柑，以廣東新會所產陳皮最為道地，亦稱“新會陳皮”。由于廣陳皮與陳皮化學成分較為接近，目前尚無簡單有效的鑒別方法對兩者進行區分，尤其當藥材加工為飲片或粉末時鑒別難度大大增加，不利于廣陳皮與陳皮產業的健康發展，故尋找一種快速簡便的方法準確鑒別廣陳皮與陳皮顯得尤為重要。

2015 年版《中國藥典》 及相關報道中關于陳皮薄層鑒別大多僅以橙皮苷為單一指標［1，7］，未能全面反映陳皮藥材特征且難以區分廣陳皮與陳皮。而相關文獻表明［8］，陳皮中除了含量較高的橙皮苷外，多甲氧基黃酮類成分如川陳皮素也是其主要成分之一，具有顯著的抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用［9?11］。此外，陳皮中還富含揮發油成分［12］，具有抗氧化、平喘鎮咳、抗炎抑菌等良好作用［13?14］。故本實驗在藥典的基礎上加以改進，采用薄層色譜法同時鑒別黃酮類成分橙皮苷、川陳皮素及揮發性成分2?甲氨基?苯甲酸甲酯，建立客觀科學的標準以快速鑒別區分廣陳皮與陳皮。

1 材料

HK?04B 搖擺式粉碎機（廣州市旭陽機械設備有限公司）；ME 104 電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；KQ?800KDE 超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；ZF?20D 暗箱式紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限公司）；Canon EOS M3 照相機（日本Canon 公司）；1～10 μL 玻璃點樣毛細管（華西醫科大學儀器廠）；薄層色譜雙槽展開缸（20 cm×20 cm，上海信誼儀器廠有限公司）；硅膠G60 薄層玻璃板（10 cm×20 cm，德國Merck 公司）；硅膠GF254薄層玻璃板（20 cm×20 cm，山東煙臺江友硅膠開發有限公司）；硅膠G60 薄層鋁板（20 cm×20 cm，德國Merck 公司）；硅膠GF254薄層鋁板（20 cm×20 cm，上海薩恩化學技術有限公司）。橙皮苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST?15070211，純度≥98%）；川陳皮素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST?15110911，純度≥99%）；2?甲氨基?苯甲酸甲酯對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號K1809090，純度≥98%）。20 批廣陳皮與14 批陳皮藥材于2017 年10月至2018 年12 月收集自全國各柑橘主產地，并均經廣州醫科大學藥學院鄭國棟教授鑒定為正品，信息見表1。其他試劑均為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 取適量橙皮苷、川陳皮素及2?甲氨基?苯甲酸甲酯對照品，加甲醇搖勻后制得含1.39 mg／mL橙皮苷、1.00 mg／mL 川陳皮素、0.14 mg／mL 2?甲氨基?苯甲酸甲酯的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備 取適量樣品于打粉機內進行粉碎并過40 目篩。精密稱取0.5 g 藥材粉末置于具塞錐形瓶，加入5 mL 甲醇，密塞，稱定質量，超聲提取30 min（320 W），放冷后用甲醇補足減失的質量，濾過，取上清液，即得。

2.3 薄層色譜鑒別 采用2015 年版《中國藥典》 薄層色譜法（第四部通則0502），吸取對照品、供試品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G60薄層板上，先以環己烷?乙酸乙酯（5 ∶1）為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干；再以乙酸乙酯?甲醇（10 ∶3）為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干；最后以環己烷?乙酸乙酯（1 ∶1）為展開劑，展至約5.5 cm，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇試液，置于紫外燈（365 nm）下驗視，結果見圖1，可知廣陳皮供試品色譜在與對照品色譜對應的位置均顯示相同顏色的斑點，而陳皮供試品色譜中無明顯的2?甲氨基?苯甲酸甲酯斑點。

圖1 34 批樣品薄層色譜圖

2.4 薄層色譜方法學驗證

2.4.1 專屬性試驗 吸取橙皮苷對照品溶液（1.39 mg／mL）、川陳皮素對照品溶液（1.00 mg／mL）、2?甲氨基?苯甲酸甲酯對照品溶液（0.14 mg／mL）、藥材供試品溶液（S7、S9、S20、S23）各2 μL，在“2.3”項條件下展開，未噴1%三氯化鋁乙醇試液前于UV 365 nm 處檢識，結果見圖2，可知供試品色譜與川陳皮素、2?甲氨基?苯甲酸甲酯對照品相應位置顯示相同顏色的斑點。再噴以1%三氯化鋁乙醇試液后于UV 365 nm 處檢識，發現橙皮苷對照品斑點變成亮黃色，且供試品色譜在相應位置呈現相同顏色的斑點，表明該方法專屬性良好。

圖2 專屬性試驗結果

2.4.2 穩定性試驗 吸取對照品溶液以及供試品溶液（放置0、1、3 d）各2 μL，在“2.3”項條件下展開，噴以1%三氯化鋁乙醇試液于UV 365 nm 處檢識。結果表明，供試品溶液在3 d 內穩定性良好。

2.4.3 耐用性試驗 吸取對照品溶液與供試品溶液（S7、S9、S20、S23）各2 μL，按“2.3”項下條件考察不同廠家薄層板的層析效果，結果見圖3，可知不同廠家的薄層板（包括玻璃板和鋁板、G60硅膠板和GF245硅膠板）均能檢測到橙皮苷、川陳皮素、2?甲氨基?苯甲酸甲酯，且分離效果良好，提示該方法耐用性良好，適用性廣泛。

圖3 不同廠家薄層板的薄層色譜圖對比

3 討論

3.1 樣品前處理方法考察 考察了臨用前粉碎、放置一段時間（1 d、20 d、6 個月）的藥材粉末。圖4 表明，放置一段時間的廣陳皮粉末色譜圖中2?甲氨基?苯甲酸甲酯斑點明顯減弱甚至消失，提示粉碎后陳皮藥材油室被破壞，揮發性成分2?甲氨基?苯甲酸甲酯易散失，不利于保存，故應選擇在臨用前粉碎藥材。

圖4 臨用前粉碎、放置一段時間藥材粉末薄層色譜對比

3.2 供試品溶液制備方法 《中國藥典》 關于陳皮的薄層色譜鑒別中，采用了加熱回流法提取并進行適當濃縮，但較為繁瑣復雜，而且難以準確把溶液濃縮至1 mL。本實驗采用超聲提取法，取0.5 g 樣品粉末，加5 mL 甲醇提取20 min（320 W），該方法方便快捷，薄層色譜圖上主斑點清晰明顯，可用于供試品溶液的制備。

3.3 展開系統選擇 由于3 種指標成分橙皮苷、川陳皮素、2?甲氨基?苯甲酸甲酯極性相差較大，采用同一種展開劑難以把三者有效分離，故本實驗考慮根據三者極性的大小采用3 次展開法。首先采用環己烷?乙酸乙酯（5 ∶1）展至8 cm 以分離2?甲氨基?苯甲酸甲酯等小極性成分，然后采用乙酸乙酯?甲醇（10 ∶3）展至3 cm 以分離橙皮苷等大極性成分，最后采用環己烷?乙酸乙酯（1 ∶1）展至5.5 cm以分離川陳皮素等中低極性成分。此外，在該展開系統下橙皮苷、川陳皮素、2?甲氨基?苯甲酸甲酯的Rf 值分別為0.22、0.39、0.76，均在0.2～0.8 的范圍內，符合薄層色譜的要求。

3.4 方法的優良性 采用該方法時，主斑點清晰平整，指標成分彼此有效分離，能有效定性鑒別陳皮中的橙皮苷、川陳皮素及2?甲氨基?苯甲酸甲酯。根據果實的成熟度及采收時間，道地藥材新會陳皮一般分為柑青皮（農歷立秋至寒露之間）、微紅皮（農歷寒露至小雪之間）、大紅皮（農歷小雪至冬至之間），本實驗對柑青皮、微紅皮、大紅皮3種類型新會陳皮樣品進行全面考察，結果均顯示明顯的2?甲氨基?苯甲酸甲酯斑點。此外，在供試品色譜中其他產地廣陳皮也顯示出明顯的2?甲氨基?苯甲酸甲酯斑點，而其他品種陳皮在橙皮苷和川陳皮素含量上與廣陳皮差異較大，均無明顯的2?甲氨基?苯甲酸甲酯斑點，表明2?甲氨基?苯甲酸甲酯為廣陳皮特征性成分。與采用單一指標成分作為判別依據的文獻相比［1，15］，該方法同時結合3 種指標成分對廣陳皮與陳皮進行分析，更能全面反映兩者在化學成分上的共性與異性，故可作為其快速鑒別的有效手段。