夏枯草酶解水提液分級醇沉及其抗HSV?1 活性

張群鑠譚紅勝 付文衛尚宇婧徐宏喜*

（1.上海中醫藥大學中藥學院，上海201203； 2.上海交通大學醫學院，上海 200025）

單純性皰疹是單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）所引起的一種急性皰疹性皮膚病，此病毒終生感染宿主，可引起從簡單的口腔和外生殖器潰瘍到非常嚴重的腫瘤和腦炎等一系列疾病［1］。目前臨床上的治療藥物以阿昔洛韋等核苷類抗病毒藥物為主，但由于長期大量的使用，臨床已產生耐藥病毒株［2］。因此，開發具有新型抗病毒作用機制的藥物來取代或者輔助洛韋類用藥迫在眉睫。

徐宏喜等［3?5］對300 多種中藥進行了系統的抗病毒篩選，首次報道夏枯草水提物具有體外抗HSV?1 活性，繼而對夏枯草多糖進行了抗HSV 活性的導向分離，獲得了分子量分別3 500 和8 500 的2 個多糖組分，初步化學研究顯示為木質素多糖復合物；用夏枯草提取物制備的凝膠制劑，體內豚鼠動物模型（HSV?1）及小鼠動物模型（HSV?2）均有活性，且無細胞毒性；進一步研究發現，夏枯草多糖通過阻止病毒吸附和穿透進入宿主細胞而發揮作用，作用機制與阿昔洛韋的直接殺滅病毒不同［6?12］。

目前，多數文獻將夏枯草水提醇沉部分默認為夏枯草多糖，其分離方法也多以提高多糖純度為目標。本實驗將夏枯草酶解提取液用乙醇梯度沉淀分段，以抗HSV 活性為導向，嘗試尋找夏枯草抗HSV 活性組分，分析各部分成分組成，以期為進一步探尋夏枯草抗HSV 復合多糖構效關系提供研究基礎。

1 材料

夏枯草（批號2018052102）購自上海華鷹藥業有限公司，經上海中醫藥大學中藥學院生藥教研室張紅梅副教授鑒定為正品。纖維素酶（批號64001136）、D?葡萄糖（批號101330576）、沒食子酸（批號20180710）、考馬斯亮藍G?250、無水碳酸鈉、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、磷酸，均購自上海國藥試劑有限公司；牛血清蛋白（批號Exp2019103）購自上海泰坦科技股份有限公司；磷鉬鎢酸試液（上海化科實驗器材有限公司）；細胞活力檢測試劑盒CCK8（上海李記生物科技有限公司）。

Vero 非洲綠猴腎細胞購自美國模式培養物集存庫，貨號CCL?81；10%胎牛血清100 U／mL 青霉素、100 μg／mL 鏈霉素（美國Hyclone 公司）；2 mM L?谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉、DMEM 培養液（美國Gibco 公司）。

HSV?1 GHSV?UL46 株購自美國模式培養物集存庫，貨號VR?1544。

粉碎機、冷凍干燥機（Alpha 2?4 LDplus CHRTST）；旋轉蒸發儀（RV10DS25 IKA）；CP225D 分析天平（德國Sartorius 公司）；centrifuge 5810R 離心機（德國Eppendorf公司）；SK7200HP 超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）；紫外分光光度計（Mapapa P3）；酶標儀SpectraMax M2e（美國Molecular Device 公司）。

2 方法與結果

2.1 夏枯草酶解水提物分級醇沉 取夏枯草果穗，粉碎過2 號篩，取100 g 粉末，加5 g 纖維素酶混勻，加10 倍水于50 ℃攪拌3 h，迅速升溫至100 ℃滅活，加10 倍水煎煮2次，每次1.5 h，所得濾液合并濃縮后，依次用20%、30%、40%、50%、60%、70%乙醇醇沉，醇沉液于4 ℃靜置12 h 后，4 000 r／min 離心30 min，取沉淀冷凍干燥得各分級醇沉部分（依次為 PVLM?1、PVLM?2、PVLM?3、PVLM?4、PVLM?5、PVLM?6）

2.2 抗HSV?1 活性測試 CPE（cytopathic effect）指病毒在宿主細胞內大量增殖，導致細胞病變甚至死亡的現象，通過檢測細胞活力，CPE 實驗被廣泛用于化合物對可引起細胞病變的病毒的抑制活性測定［13］。本研究應用該實驗，采用Vero 細胞、GHSV?UL 46 病毒株、CCK8 檢測試劑、Acyclovir 陽性對照，化合物處理5 d／終點法，檢測受試樣品對HSV?1 的體外抑制活性。

將Vero 細胞以每孔10 000 個細胞的濃度接入96 孔細胞培養板中，并于5% CO2、37 ℃培養箱中培養過夜。第2天分別加入受試樣品／陽性對照化合物和病毒（MOI ＝0.02）。細胞培養液中的DMSO 終濃度為0.5%。細胞在37 ℃、5% CO2條件下繼續培養5 d 至病毒對照孔（細胞感染病毒，無化合物處理）內細胞病變率達到80%～95%。細胞毒性實驗與抗病毒實驗同時進行測試，實驗條件一致，但無病毒感染。

使用細胞活力檢測試劑CCK8 檢測細胞活力。受試樣品的抗病毒活性和細胞毒性分別由受試樣品對病毒引起的細胞病變效應的抑制率和細胞活率表示。計算公式如下。

使用GraphPad Prism（version 5）軟件對受試樣品的抑制率和細胞活率進行非線性擬合分析，得到受試樣品的EC50和CC50值。

結果顯示，受試樣品PVLM?1、PVLM?2、PVLM?6 對HSV?1 具有抑 制活性，EC50值分別 為60.79、42.45、101.70 μg／mL；其他受試樣品在測試濃度內沒有顯示出抗病毒活性，EC50值為大于最高檢測濃度＞250 μg／mL。

受試樣品在測試濃度內對Vero 細胞沒有顯示出細胞毒性，CC50值為大于最高檢測濃度＞250 μg／mL。見表1。

表1 夏枯草酶解水提物各梯度乙醇沉淀抗HSV?1 活性（μg／mL）

2.3 成分分析 結果見表2。

表2 夏枯草酶解水提物各梯度乙醇沉淀成分組成（%）

2.3.1 多糖含量測定 采用硫酸?苯酚法［14］，以葡萄糖為對照品，在490 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（A），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程A＝24.674X－0.3462（r＝0.999 0），在5.034～50.34 μg／mL范圍內線性關系良好。

2.3.2 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法［15］，以牛血清蛋白為對照品，于595 nm 波長處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標（A），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程A＝22.611X－0.259 7（r＝0.997 4），在1.687～16.867 μg／ mL范圍內線性關系良好。

2.3.3 多酚含量測定 采用Folin?Ciocalteu 法［16］，以沒食子酸為對照品，在760 mn 的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標（A），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程A＝10.048X－0.009 8（r＝0.999 9），在2.08～20.80 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.4 夏枯草酶解水提液30%醇沉部分多糖的純化及其活性測試

2.4.1 夏枯草抗HSV 活性部位制備 取夏枯草果穗，粉碎過篩，取粉末100 g，加5 g 纖維素酶混勻，加10 倍水于50 ℃攪拌3 h，迅速升溫至100 ℃滅活，加10 倍水煎煮2次，每次1.5 h，所得濾液合并濃縮后，加無水乙醇至醇濃度30%，于4 ℃靜置12 h 后，4 000 r／min 離心30 min，取沉淀冷凍干燥，即得。

2.4.2 柱色譜前處理 大孔樹脂D301 用95% 乙醇浸泡12 h后濕法裝柱，用95% 乙醇沖洗層析柱（體積流量2 BV／ h，BV 為樹脂體積數，下同），至流出液加2 倍蒸餾水后不產生渾濁為止，再用大量蒸餾水洗至流出液澄清，繼續洗脫2～3 BV；HCl 溶液洗層析柱（體積流量4～6 BV／h），并浸泡2～3 h，再用蒸餾水以同樣的體積流量洗至中性，用2～3 BV 4%NaOH 溶液洗層析柱（體積流量4～6 BV／h），浸泡2～3 h 后，再用蒸餾水以同樣的體積流量洗至中性。

2.4.3 柱色譜純化過程 取“2.4.1”項下夏枯草抗HSV活性部位適量，制備成質量濃度為0.3 mg／mL 的上樣液，以料液?填料1 ∶50 的比例上樣，首先用蒸餾水作流動相，5 mL 為一流分，用自動接收器接收，每一流分用濃硫酸?5%苯酚進行顯色，收集顯色者，濃縮，凍干，進行含量測定及抗HSV?1 活性檢測。再用1 mol／L NaCl 溶液作流動相，以5 mL 為一流分，用自動接收器接收，每一流分用濃硫酸?5%苯酚進行顯色，收集顯色者，3 kD 超濾離心管離心，1% AgCl 溶液檢測，去除NaCl 至無沉淀產生，凍干，按“2.3”項下方法測定多糖、蛋白質、多酚含量，按“2.2”項下方法進行體外抗HSV?1 活性檢測。結果見表3。

表3 夏枯草多糖及其他成分含量、活性測定結果

3 討論

纖維素酶解可通過酶水解破碎植物細胞壁的作用，使細胞內多糖物質充分溶出，從而提高藥用成分的提取率［16?17］。纖維素酶水解過程中應注意溫度不能過高，酶解后需立即升溫滅活。應用CPE 試驗，對夏枯草酶解水提液各梯度乙醇沉淀進行抗HSV 活性篩選，發現20% 及30%乙醇的沉淀具有良好的抗HSV?1 活性，其ED50分別為60.79、42.45 μg／mL，40%乙醇及以上的分級沉淀無活性或有較弱的活性；經大孔樹脂D301 純化后的夏枯草多糖，純度可達77.78%，但其抗HSV 活性反而喪失。通過對各部分分級醇沉及經大孔樹脂D301 純化后的夏枯草多糖進行各類成分分析發現，多糖含量的高低與其抗HSV 活性強弱并不呈現正相關，反而蛋白質及多酚類成分的去除會消除相應成分的抗HSV 活性，其構效關系有待進一步探究。