miR-506-3p靶向Beclin-1調(diào)控?zé)齻笃つw成纖維細(xì)胞的自噬和增殖機(jī)制研究

史敏　丁欣強(qiáng)　郭曉波　陳煒熒　張明雨

[摘要]目的：探討燒傷后皮膚成纖維細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)與Beclin-1的靶向關(guān)系及增殖調(diào)控作用，為燒傷后瘢痕的治療提供新靶點(diǎn)。方法：采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)燒傷組織和熱損傷皮膚成纖維細(xì)胞中miR-506-3p水平;Targetscan在線預(yù)測(cè)，雙熒光素酶驗(yàn)證miR-506-3p與Beclin-1靶向關(guān)系;qRT-PCR和Western blot檢測(cè)miR-506-3p模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染對(duì)Beclin-1表達(dá)的影響;qRT-PCR檢測(cè)熱刺激后miR-506-3p模擬物（10nM或30nM）轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞miR-506-3p的表達(dá)并采用CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖效率。結(jié)果：與正常組織相比，燒傷組織和熱損傷成纖維細(xì)胞中miR-506-3p的表達(dá)下調(diào);miR-506-3p和Beclin-1存在靶向調(diào)控作用關(guān)系，并且miR-506-3p可負(fù)調(diào)控Beclin-1表達(dá);miR-506-3p模擬物轉(zhuǎn)染以劑量依賴的方式抑制了熱刺激的真皮成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞增殖。結(jié)論：miR-506-3p通過(guò)靶向抑制Beclin-1表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)燒傷后皮膚成纖維細(xì)胞的自噬和增殖，有可能成為燒傷愈合后瘢痕治療的潛在靶標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]miR-506-3p;Beclin-1;成纖維細(xì)胞;自噬;增殖;燒傷

[中圖分類號(hào)]R644? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）08-0095-04

miR-506-3p Targets Beclin-1 to Regulate Autophagy and Proliferation of Post-burn Skin Fibroblasts

SHI Min1，DING Xin-qiang2，GUO Xiao-bo3，CHEN Wei-ying1，ZHANG Ming-yu1

（1.Medical School of Xian Peihua University，Xian 710125，Shaanxi，China;2.Department of Dermatological，Xi'an Children's Hospital，Xian 710003，Shaanxi，China;3.Clinical Laboratory， Xi'an Central Hospital，Xian 710004，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To explore the targeting relationship between the expression of miR-506-3p and Beclin-1 in heat-damaged skin fibroblasts and its proliferation regulation effect on Beclin-1， in order to provide a new target for the treatment of post-burn scars. Methods? We used qRT-PCR to detect miR-506-3p of post-burn tissue and heat-damaged skin fibroblasts， used Targetscan online prediction and dual luciferase to verify the targeting relationship between miR-506-3p and Beclin-1. We used qRT-PCR and Western blot to detect the effect of miR-506-3p mimic or inhibitor transfection on Beclin-1 expression. The expression of miR-506-3p in fibroblasts transfected with miR-506-3p mimic （10nM or 30nM） after thermal stimulation was detected by qRT-PCR and the proliferation efficiency of transfected cells was detected by CCK-8. Results? Compared with normal tissues， the expression of miR-506-3p in post-burn tissues and heat-damaged fibroblasts is down-regulated. There is a targeted regulation relationship between miR-506-3p and Beclin-1， and miR-506-3p can negatively regulate the expression of Beclin-1， and miR-506-3p mimic transfection inhibits cell proliferation in heat-stimulated dermal fibroblasts in a dose-dependent manner. Conclusion? MiR-506-3p regulates the autophagy and proliferation of post-burn skin fibroblasts by targeting the expression of Beclin-1， and may be a potential target? on scar for post-burn healing.

Key words： miR-506-3p; Beclin-1; fibroblasts; autophagy; proliferation; burn

燒傷皮膚愈合后轉(zhuǎn)化為纖維瘢痕組織，主要特征為成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖及細(xì)胞外基質(zhì)聚集[1]。瘢痕的形成嚴(yán)重影響患者身心健康，因而研究瘢痕發(fā)生機(jī)制中的基因治療靶點(diǎn)具有重要意義。大量文獻(xiàn)表明，自噬可降解異常細(xì)胞蛋白聚集體和受損細(xì)胞器的分解代謝途徑，在生物體穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用[2]。自噬水平異常可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，Beclin-1是至關(guān)重要的促自噬蛋白，然而很多因素可影響B(tài)eclin-1表達(dá)，其中就包括微小RNA（miRNA），如Chen等發(fā)現(xiàn)miR-30a通過(guò)靶向Beclin-1來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的自噬[3]，miR-30a通過(guò)下調(diào)Beclin-1表達(dá)來(lái)降低肝星形細(xì)胞的自噬活性[4]。本課題組前期研究也證實(shí)，熱損傷成纖維細(xì)胞具有miR-506-3p表達(dá)下調(diào)和自噬水平上調(diào)（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5表達(dá)顯著上調(diào)，而p62表達(dá)下調(diào)）特征。然而，就miR-506-3p與Beclin-1是否在成纖維細(xì)胞中存在靶向關(guān)系目前尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究旨在探討皮膚成纖維細(xì)胞中miR-506-3p和Beclin-1的作用關(guān)系，以期為燒傷后瘢痕的治療提供新靶點(diǎn)。

1? 材料和方法

1.1 組織樣本與細(xì)胞培養(yǎng)：2018年4月-2019年5月從西安市兒童醫(yī)院皮膚科收集Ⅱ度或Ⅲ度燒傷患者在燒傷后24h內(nèi)的樣本30份，將收集的燒傷皮膚組織和鄰近正常對(duì)照皮膚組織置于液氮中，并在-80℃儲(chǔ)存行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。取材前獲得患者本人或家屬簽署的知情同意書，所有實(shí)驗(yàn)操作均獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。患者在術(shù)前1年內(nèi)未接受任何治療，無(wú)腫瘤病史。

人皮膚成纖維細(xì)胞系HSAS4和人胚腎293T（HEK 293T）細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)提供。所有細(xì)胞在37℃ 5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，DMEM含100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的抗生素混合物，并含10%胎牛血清。建立細(xì)胞熱損傷模型，將HSAS4細(xì)胞培養(yǎng)物放入熱水器槽中，在52℃下孵育30s（模擬燒傷狀態(tài)），然后在正常條件下孵育。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：miR-506-3p模擬物、miR-506-3p抑制劑和相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC模擬物和NC抑制劑）購(gòu)自RiboBio。基因過(guò)表達(dá)載體（Ad-Beclin-1）和對(duì)照載體購(gòu)自GenScript Biotech公司。真皮siRNA成纖維細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到六孔板中，然后用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)說(shuō)明書，采用Lipofectamine 2000質(zhì)粒或寡核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析：依Trizol試劑指導(dǎo)提取皮膚成纖維細(xì)胞和皮膚組織總RNA;采用PrimeScript RT試劑盒和Mir-XTM miRNA試劑盒（塔卡拉，中國(guó)大連）分別將mRNA和miRNA均反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒和SYBR PrimeScript? miRNA RT-PCT試劑盒（購(gòu)自美國(guó)加利福尼亞州福斯特城）通過(guò)7900HT實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems Inc.，美國(guó)加利福尼亞州福斯特城）測(cè)量mRNA和miRNA的表達(dá)水平。基因特異性引物：miR-506-3p正向5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′，反向5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′;Beclin-1正向：5'-CCATGCAGGTGAGCT TCGT-3'，反向：5'-GAATCTGCGAGAGACACCATC-3';U6正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';β肌動(dòng)蛋白正向：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反向5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。β肌動(dòng)蛋白和U6分別用作mRNA和miRNA檢測(cè)的內(nèi)源參照。實(shí)驗(yàn)操作至少獨(dú)立重復(fù)三遍，使用相對(duì)定量2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞增殖效率，然后用微孔板在0h、24h和72h讀取細(xì)胞增殖效率。首先，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以1.0×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在六孔板中，然后將8μl CCK-8和100μl無(wú)FBS的培養(yǎng)基添加到每個(gè)孔中，暗箱孵育2h。最后，在每個(gè)指示時(shí)間點(diǎn)通過(guò)測(cè)量450nm處的吸光度來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三遍。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：Beclin-1和miR-506-3p序列從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）中檢索。在線數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）用于預(yù)測(cè)miR-506-3p和Beclin-1 3'-UTR之間的結(jié)合位點(diǎn)。將Beclin-1 mRNA的野生型或突變型3'-UTR克隆到pmirGLO熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（Promega，Madison，WI，USA）中。將HEK-293T細(xì)胞接種在24孔板中，并用熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染。48h后，根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用Dual-Luciferase Reporter基因分析系統(tǒng)（Promega Corporation，E1910）檢測(cè)熒光素酶活性。所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡分析：利用RIPA裂解緩沖液從燒傷的皮膚組織、正常組織和轉(zhuǎn)染的HSAS4細(xì)胞中獲得總蛋白裂解物，以10 000×g離心10min。然后，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)SDS-PAGE分離每種樣品中25μg蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h后，將膜分別與第一抗體在4℃下孵育過(guò)夜，將β肌動(dòng)蛋白設(shè)置為內(nèi)源性對(duì)照。然后，將膜與第二抗體IgG在室溫下再溫育2h。最后，將蛋白質(zhì)印跡可視化并用ECL-Plus Western Blot檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三遍。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 22.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每次檢測(cè)至少?gòu)娜螌?shí)驗(yàn)中獲得，并表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用t檢驗(yàn)對(duì)配對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，并使用單向方差分析（ANOVA）進(jìn)行兩組以上的組間比較，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 燒傷組織和熱損傷成纖維細(xì)胞中miR-506-3p的表達(dá)：采用qRT-PCR檢測(cè)30例患者燒傷組織及其毗鄰正常組織中的miR-506-3p表達(dá)水平。與正常組織相比，燒傷組織中miR-506-3p的表達(dá)下調(diào)（見圖1A）。同時(shí)，經(jīng)52℃熱處理后皮膚成纖維細(xì)胞的miR-506-3p表達(dá)低于未行熱處理的對(duì)照組，且在48h時(shí)下調(diào)最明顯（見圖1B）。

2.2 miR-506-3p與Beclin-1靶向作用關(guān)系驗(yàn)證：采用在線生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)miR-506-3p的下游靶點(diǎn)，結(jié)果表明miR-506-3p可與Beclin-1 mRNA的3'-UTR結(jié)合（見圖2A）。雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因測(cè)定表明，用miR-506-3p模擬物轉(zhuǎn)染后，WT-Beclin-1 3'-UTR的熒光素酶活性顯著降低。而與對(duì)照組相比，熒光素酶活性在包含MUT-Beclin-1 3'-UTR的熒光素酶報(bào)告載體中無(wú)明顯變化（見圖2B）。

2.3 miR-506-3p可負(fù)調(diào)控成纖維細(xì)胞Beclin-1表達(dá)：使用qRT-PCR和Western blot分析檢測(cè)miR-506-3p模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染對(duì)Beclin-1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在熱損傷皮膚成纖維細(xì)胞中，miR-506-3p的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Beclin-1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著降低，而抑制miR-506-3p則增加了皮膚成纖維細(xì)胞Beclin-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平（見圖3A～B）。這些數(shù)據(jù)表明，miR-506-3p可直接與Beclin-1結(jié)合并負(fù)調(diào)控Beclin-1的表達(dá)。

2.4 miR-506-3p以劑量依賴性方式抑制熱刺激下的細(xì)胞增殖：將濃度為10nM、30nM的miR-506-3p模擬物于體外轉(zhuǎn)染，檢測(cè)miR-506-3p在熱刺激下成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明，熱刺激下調(diào)了miR-506-3p的表達(dá)，但用miR-506-3p模擬物轉(zhuǎn)染后，以劑量依賴性方式逆轉(zhuǎn)了這種作用（見圖4A）。同時(shí)，用miR-506-3p模擬物轉(zhuǎn)染也顯著降低了熱刺激成纖維細(xì)胞的生存力（見圖4B）。這些結(jié)果表明，miR-506-3p的過(guò)表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖。

3? 討論

瘢痕是皮膚科和整形外科最常見的創(chuàng)傷后表現(xiàn)，是創(chuàng)傷后患者抱怨的一大問(wèn)題，尋找瘢痕形成的機(jī)制及治療靶點(diǎn)是臨床治療重要方向。目前miRNA及細(xì)胞自噬在纖維化疾病研究中備受關(guān)注，但在瘢痕形成中的生物學(xué)效應(yīng)尚不明確。瘢痕形成是成纖維細(xì)胞異常增殖和胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度沉積所致，成纖維細(xì)胞作為瘢痕形成的主要效應(yīng)細(xì)胞，研究成纖維細(xì)胞的自噬水平對(duì)瘢痕預(yù)防及治療具有重要意義。大量文獻(xiàn)表明，miRNA調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)，在瘢痕形成中存在異常表達(dá)[5]。例如，miR-181a通過(guò)PHLPP調(diào)節(jié)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡和增殖[6]。miR-181b-5p通過(guò)調(diào)節(jié)MEK/ERK/p21路徑促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[7]。本次研究也證實(shí)，在燒傷皮膚組織和熱刺激的皮膚成纖維細(xì)胞中，miR-506-3p表達(dá)顯著下調(diào)，提示miR-506-3p與瘢痕形成具有顯著關(guān)聯(lián)，可作為瘢痕和纖維化疾病診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。

自噬與纖維化疾病密切相關(guān)，自噬參與瘢痕形成中成纖維細(xì)胞增殖、異常生長(zhǎng)調(diào)控、細(xì)胞因子的分泌及基質(zhì)的合成降解等，在瘢痕發(fā)生的各階段發(fā)揮不同作用[8-9]。Beclin-1作為第一個(gè)被鑒定為哺乳動(dòng)物自噬基因和酵母ATG6的直向同源物，是PI3KC3的重要成分，其參與自噬體形成，是至關(guān)重要的促自噬蛋白。有證據(jù)表明，miRNA參與了細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)并影響著瘢痕的形成。徐心雨發(fā)現(xiàn)miR-216b通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Beclin-1表達(dá)實(shí)現(xiàn)由HPCT誘導(dǎo)的人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的自噬和凋亡水平[10]。Cao等[11]證明Beclin-1下調(diào)會(huì)顯著抑制成纖維細(xì)胞活性和膠原蛋白合成，從而抑制肥厚性瘢痕的形成。在本研究中，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因分析評(píng)估，驗(yàn)證了Beclin-1是miR-506-3p的直接靶標(biāo)，miR-506-3p可通過(guò)靶向Beclin-1調(diào)節(jié)燒傷組織成纖維細(xì)胞的行為。在進(jìn)一步的研究中證實(shí)，miR-506-3p轉(zhuǎn)錄后靶向抑制Beclin-1表達(dá)。然而，miR-506-3p模擬物轉(zhuǎn)染后，不僅顯著降低熱損傷成纖維的細(xì)胞生存力，并且以劑量依賴性方式逆轉(zhuǎn)這種作用。因此，miR-506-3p靶向Beclin-1調(diào)控?zé)齻笃つw成纖維細(xì)胞的自噬和增殖，這將可能被認(rèn)為是傷口愈合的新治療策略，但未來(lái)尚需進(jìn)一步對(duì)miRNA和自噬進(jìn)行研究以幫助人們更好地認(rèn)識(shí)其抗瘢痕效應(yīng)。

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[收稿日期]2021-02-07

本文引用格式：史敏，丁欣強(qiáng)，郭曉波，等.miR-506-3p靶向Beclin-1調(diào)控?zé)齻笃つw成纖維細(xì)胞的自噬和增殖機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（8）：95-98.