人臍血間充質干細胞（hUCMSCs）復合PHAs生物材料誘導軟骨再生的研究

張翠　何珊　周林

[摘要]目的：研究人臍血間充質干細胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）經基因誘導成軟骨后復合支架材料，構建組織工程軟骨，探究軟骨再生過程中，移植物在宿主體內的營養代謝及宿主免疫反應。方法：從人臍帶血中分離、擴增、培養人臍血間充質干細胞并鑒定;在倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態，成軟骨誘導后復合支架載體，體外共培養1周，植入SD大鼠體內，分時段取材（7d，14d，28d）后，進行大體形態學觀察，組織化學染色、軟骨特異性基質成分蛋白多糖及Ⅱ型膠原纖維的表達變化檢測;對照組SD大鼠移植同種異體胸骨劍突軟骨;空白對照組SD大鼠不做任何處理。結果：HE染色結果顯示：實驗組和對照組炎癥反應未見明顯差異。大體形態學觀察及組織學染色結果均顯示，實驗組28d左右可見成熟軟骨形成。糖蛋白多糖檢測結果顯示新生軟骨組織在實驗組和對照組無顯著差異。宿主表現為局部的纖維囊壁包裹弱炎癥反應。結論：hUCMSCs構建的組織工程軟骨，軟骨再生情況良好，支架材料按時吸收，宿主弱免疫反應，在干細胞治療軟骨缺損方面顯示出了一定的臨床潛力。

[關鍵詞]人臍血間充質干細胞;組織工程;軟骨再生;免疫反應;體內;軟骨形成

[中圖分類號]R318? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）08-0103-04

Cartilage Regeneration Induced by Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells （hUCMSCs） Combined with PHAs Biomaterials

ZHANG Cui1，HE Shan1，ZHOU Lin2

（1.Department of Stomatology，the Second Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 710065，Shaanxi，China;

2.Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 710061，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To study the cartilage regeneration of human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUCMSC） after gene induction into cartilage and composite scaffold materials to construct tissue engineered cartilage in vitro and transplant it into SD rats. Methods? Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells were isolated， expanded， cultured， and identified. The cell morphology was observed by inverted phase-contrast microscope. co-cultured? for 1 week and implanted into SD rats，collected materials regularly （7d， 14d， 28d），? and observation， histological staining， and expression of cartilage-specific matrix component proteoglycan. Observe the nutrient metabolism and host immune response in the process of graft cartilage regeneration. SD rats in the control group were transplanted with allogeneic sternal xiphoid cartilage; SD rats in the blank control group do nothing. Results? The HE results of the graft showed that there was no significant difference in the postoperative inflammation between the experimental group and the control group. Gross morphological observation and histological staining results confirmed that mature cartilage formed in the experimental group around 28 days. Glycoproteoglycan test results showed that the experimental group and the control group were similar. The host showed weak local inflammation. Conclusion? The tissue engineered cartilage constructed by hUCMSCs has good cartilage regeneration and weak host immune response. It shows a certain clinical potential in the treatment of cartilage defects with stem cells.

Key words： human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUCMSC）; tissue engineering; cartilage regeneration; immune response; in vivo; chondrogenesis

頭頸頜面部是人體軟骨較多的區域，由于不同原因造成軟骨缺損后，因其自身無血管、神經等特性，自我修復困難[1]。目前臨床上軟骨缺損主要依靠移植人工材料進行缺損部位的修復重建[2-3]，但是受到異物反應、宿主免疫排斥反應以及感染等問題的影響，臨床使用受限。因此仍在不斷研究和探索新的軟骨缺損的修復重建方法。

組織工程學方法和干細胞研究在軟骨缺損方面顯示出了巨大的臨床潛力[4-5]。結合基因治療，種子細胞生長條件優化，生長因子促進軟骨再生，支架材料的基因蛋白修飾等是目前國內外軟骨組織工程研究的熱點[6]。但是真正再生軟骨應用于臨床，新軟骨形成的質量及支架材料的吸收速率是最受關注的問題之一[7-8]，這也是目前干細胞應用于軟骨組織工程研究的難點及亟待解決的問題[9-11]。如何更好地將干細胞結合在具有一定促進軟骨再生的生長因子覆蓋的支架材料上，在低免疫反應的輔助下，實現頜面軟骨缺損處的再生修復是一直思考的問題。本實驗擬通過將Sox9基因轉染人臍血間充質干細胞后誘導軟骨細胞形成作為種子細胞，復合PHAs支架材料以構建組織工程軟骨，并移植到動物體內，研究其軟骨再生能力和程度，為其安全應用于實際臨床，提供一定的理論依據和臨床思路。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物、臍帶血：實驗用臍帶血，采集于西安交通大學第二附屬醫院院產科，經家屬同意。實驗用雌雄各半SD大鼠共120只，體重（150±20）g。由西安交通大學醫學部無菌動物實驗中心提供，SPF級飼養。

1.2 主要試劑與儀器：透明質酸酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma，美國）;胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Invitrogen，美國）;Ⅱ型膠原一抗（鼠抗;Neomarker，美國）;Aggrecan單克隆抗體（羊抗;Santa Cruz， 美國），CO2孵育箱（Thermo，日本）;熒光顯微鏡（Nikon，日本）。高糖培養液（Dulbeccos modified Eagles medium，DMEM）、胰蛋白酶（GIBCO，美國）。

1.3 方法

1.3.1 干細胞誘導和鑒定：分離hUCMSC，并倒置顯微鏡觀察，傳代穩定后，Sox9基因轉染誘導成軟骨細胞并鑒定[12-13]。課題組前期已在實驗中驗證[14]。

1.3.2 支架材料準備：本實驗所用PHAs為西安交通大學轉化醫學實驗室饋贈。將PHAs三維支架制備成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小立方體，酒精浸泡24h，紫外照射30min，備用[15]。超微投射電子掃描顯微鏡觀察支架材料結構。

1.3.3 人臍帶血干細胞復合支架材料構建干細胞組織工程軟骨：將制成1×107ml的人臍血間充質干細細胞懸液，向48孔培養板中放置的PHAs支架材料上滴加，每塊支架滴加40μl，細胞懸液充分浸入PHAs的各個孔隙內。添加DMEM-F 12 500μl。將培養板靜置于體積分數5% CO2、37℃培養箱內培養。體外培養1周，觀察hUCMSC在三維支架材料中的形態和分布[14]。

1.3.4 移植動物模型的建立：實驗分組：實驗組、對照組、空白組（n=8）。將SD大鼠用1%戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉（300g/ml）;待麻醉起效后，大鼠俯臥位固定;備皮（大鼠脊柱處脫毛），術區常規消毒，鋪巾;實驗組將構建的組織工程軟骨植入SD大鼠背部皮下腔隙;對照組同樣方法移植同種異體SD大鼠胸骨劍突軟骨;空白組不移植;間斷縫合創口。待大鼠清醒后隨機放入籠中常規飼養。體內培養7d、14d、28d后取材。

1.3.5 組織學觀察：組織塊按時間取材后，肉眼大體形態觀察，同時每塊組織4%多聚甲醛溶液4℃固定過夜，常規梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片10μm，脫蠟;行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察其病理結構;Masson染色檢測Ⅱ型膠原纖維，甲苯胺藍（TB）染色、番紅〇染色檢測糖胺多糖（Glycosaminoglycan，GAG）。Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測Ⅱ型膠原纖維的表達情況。

1.3.6 超微透射電子掃描顯微鏡觀察：將取材組織固定，4%多聚甲醛溶液4℃固定后，西安交通大學行掃描電子顯微鏡觀察再生軟骨的增殖情況。

2? 結果

2.1 hUCMSCs基因誘導后細胞觀察：體外培養14d，hUCMSCs貼壁生長，細胞形態為梭形成纖維樣、透光性強，后逐漸融合，呈旋渦狀，見圖1A。hUCMSCs經Sox9基因過表達定向誘導分化為軟骨細胞，細胞形態呈三角形、多邊形，甲苯胺藍染色細胞核藍染、漿藍紫染，見圖1B。由此可見，人臍血間充干細胞定向分化為軟骨細胞，且分化結果良好。

2.2 PHAs支架掃描超微透射電子顯微鏡觀察：PHAs超微結構呈多孔狀纖維縱橫交錯，膠原包被形成天然密集的微孔網狀三維結構，表面粗糙分布均勻的孔隙。見圖2。

2.4 HE染色、TB染色、番紅〇染色及Masson染色結果：圖4中HE染色、TB染色、番紅〇染色結果顯示：14d時細胞分化為圓形，細胞增殖，密集，細胞間隙小，基質少;28d時新生軟骨形成并逐漸成熟，細胞分泌大量基質，典型透明軟骨樣組織形成，細胞間隙大，基質豐富，蛋白多糖分泌旺盛，呈片狀分布;軟骨細胞排列更加規則有序，軟骨陷窩及軟骨囊規則典型。Masson染色結果示：14d可檢測到Ⅱ型膠原的表達。

2.5 掃描超微透射電子顯微鏡結果：14d時，細胞變為圓形，支架材料空隙內有大量的球形軟骨細胞，周圍包繞紅細胞以及淋巴細胞。28d時細胞越來越多，細胞間隙減少，分布排列更加規則。越來越接近于對照組。見圖5。

2.6 Ⅱ型膠原免疫組化結果：細胞形態從細長的成纖維樣表型，變為球形到多邊形，14d時可檢測到Ⅱ型膠原的表達，與Masson染色，結果吻合，28d時Ⅱ型膠原增多，接近于對照組。見圖6。

2.7 實驗組移植物周圍纖維包裹組織形態觀察：7d時可見移植物周圍纖維包膜形成，淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、吞噬細胞及紅細胞聚集可見大量成纖維細胞及新生毛細血管，炎細胞浸潤，隨時間延長，包膜逐漸增厚，分葉狀的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞及淋巴細胞大量聚集;14d時可見包膜膠原纖維增厚變粗，毛細血管豐富，炎性細胞密集排列;28d時包膜成熟，基質分泌多，纖維結締組織樣包膜形成。見圖7。

2.8 實驗組軟骨形成過程中支架材料的吸收情況：7d時支架部分開始松解，周圍大量吞噬細胞包繞已分解的支架塊;14d時支架處于快速降解期;28d時大部分支架降解。PHAs支架的降解是通過炎細胞的包裹吞噬方式降解，其降解速率與軟骨再生速率在SD大鼠體內基本吻合。見圖8。

3? 討論

人臍血間充質干細胞（hUCMSCs）具有免疫原性低、道德倫理爭議少等優點，被認為是良好的種子細胞。PHAs是一種無毒、可降解，具有良好生物相容性的支架材料，本實驗將基因誘導過的hUCMSCs復合PHAs支架材料，移植入SD大鼠體內背部皮下培養。實驗表明：28d可再生出透明軟骨，性狀接近對照組正常軟骨。PHAs支架材料在28d左右降解，其方式通過炎細胞的包裹吞噬，降解速率和再生軟骨速率吻合，移植周圍僅表現為局部炎細胞浸潤（淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞及嗜酸性細胞），移植物周圍纖維結締樣組織包裹，包膜隨時間增長逐漸包裹完全，28d左右包膜周圍形成豐富的新生毛細血管網為其軟骨再生以及支架材料的降解提供營養支持。

盡管如此，干細胞構建的組織工程軟骨，在應用于臨床之前，移植物組織及細胞在宿主體內的最終轉歸機制，仍需要進一步深入的研究和探討。其中包括：生長因子在干細胞定向軟骨細胞分化過程中，以及軟骨形成的各個階段，多個步驟中如何作用，特別是轉化生長因子-β（TGF-β）超家族成員TGF-β，骨形態發生蛋白（BMP）和成纖維細胞生長因子（FGF）的作用[16];干細胞構建的組織工程軟骨，在細胞分化過程中，分子機制如何調控，引導其更有效的形成軟骨[2];干細胞治療過程的歸巢性，即在體內微環境作用下主動遷移至軟骨缺血或受損部位進行修復受損細胞與細胞重建等。

下一步研究計劃中hUCMSCs復合支架治療構建組織工程軟骨應用于體內軟骨再生研究過程中，干細胞作用機制，細胞旁分泌、自分泌的影響、Notch信號通路的影響，以及干細胞應用于臨床其營養供給和新陳代謝的途徑，需要進一步明確組織工程軟骨移植于受體體內其血管化再生，以及宿主的免疫抑制機制等方面可作為新的研究思路，繼續深入研究。同時，隨著3D打印技術的發展，計算機模型也可能在再生醫學研究中發揮重要作用[17]。隨著組織工程軟骨工程研究的深入，以及干細胞治療學科的進一步發展，生命基礎科學與臨床科學的結合交互研究，為干細胞構建的人工軟骨應用于臨床，提供更多理論及實踐依據。

總之，本實驗證明Sox9基因誘導的hUCMSCs分化所得軟骨細胞復合PHAs支架材料，構建的組織工程軟骨，在動物體內的軟骨再生情況良好，支架材料有一定的生物機械強度并能按時降解，同時移植物在宿主體內主要表現為宿主局部纖維囊壁包裹的炎癥反應。因此，認為該實驗方法構建的組織工程軟骨，在軟骨缺損修復和功能重建方面顯示出了一定的臨床潛力，為其進一步應用于臨床提供了必要的依據。

[參考文獻]

[1]Chung C，Burdick JA.Engineering cartilage tissue[J].Adv Drug Deliv Rev，2008，60（2）：243-262.

[2]Suh JKF，Matthew HWT.Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering： review[J].Biomaterials，

2000，21（24）：2589-2598.

[3]Kenneth Zaslav，Brian Cole，Robert Brewster，et al.A prospective study of autologous chondrocyte implantation in patients with failed prior treatment for articular cartilage defect of the knee： results of the Study of the Treatment of Articular Repair （STAR） clinical trial[J].Am J Sports Med，2009，37（1）：42-55.

[4]JS Boo，Y Yamada，Y Okazaki，et al.Tissue-engineered bone using mesenchymal stem cells and a biodegradable scaffold[J].J Craniofac Surg，2002，13（2）：231-239，discussion 240-243.

[5]Hutmacher DW.Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage[J].Biomaterials，2000，21（24）：2529-2543.

[6]Evans CH，Ghivizzani SC，Smith P，et al.Using gene therapy to protect and restore cartilage[J].Clin Orthop Relat Res，2000，（379 Suppl）：S214-S219.

[7]Olivia S Beane，Eric M Darling.Isolation， characterization， and differentiation of stem cells for cartilage regeneration[J].Ann Biomed Eng，2012，40（10）：2079-2097.

[8]LIU Feng，JIANG Xiangling，LIU Mingming.Different culture methods for human umbilical cord mesenchymal stem cells[J].China Tissue Engineering Research，2016，20（28）：4136-4141.

[9]Suh JK，Aroen A，Muzzonigro TS，et al.Injury and repair of articular cartilage： related scientific issues[J].Oper Tech Orthop，2007，7：270-278.

[10]Athanasiou K，Korvick D，Schenck R.Biodegradable implants for the treatment of osteochondral defects in a goat model[J].Tissue Eng，2009，3（4）：363-373.

[11]Buckwalter JA，Mankin HJ.Articular cartilage： degeneration and osteoarthrosis， repair， regeneration， and transplantation[J].Instr Course Lect，1998，47：487-504.

[12]張軍，張耀明，王正輝，等.Sox9誘導人臍血干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究[J].組織工程與重建外科，2015，15（6）：45-51.

[13]張軍，徐輝，溫繡藺，等.Sox9基因轉染的人臍帶血干細胞復合骨基質明膠/生物蛋白膠構建組織工程軟骨的實驗研究[J].生物醫學工程與臨床，2018，22（1）：13-19.

[14]高天喜，常會敏，范敏杰，等.聚羥基脂肪酸酯的生物修飾及其生物相容性研究[J].中國修復重建外科雜志，2014，28（8）：1023-1029.

[15]Liao CJ，Lin YJ，Chiang H，et al.injecting partially digested cartilage fragments into a biphasic scaffold to generate osteochondral composites in a nude mice model[J].J Biomed Mater Res A，2006，81（3）：567-577.

[16]Augustyniak E，Trzeciak T，Richter M，et al.The role of growth factors in stem cell-directed chondrogenesis： a real hope for damaged cartilage regeneration[J].Int Orthop，2015，39（5）：995-1003.

[17]Geris L.Regenerative orthopaedics： in vitro， in vivo … in silico[J].Int Orthop，2014，38（9）：1771-1778.

[收稿日期]2021-01-18

本文引用格式：張翠，何珊，周林.人臍血間充質干細胞（hUCMSCs）復合PHAs生物材料誘導軟骨再生的研究[J].中國美容醫學，2021，30（8）：103-106.