自噬在葛根素促成骨細胞分化調節中的作用

于冬冬，趙丹陽，楊鶇祥

（1.遼寧中醫藥大學附屬醫院骨科，沈陽 110032；2.沈陽市第一人民醫院神經內科，沈陽 110041）

成骨細胞的分化受到抑制是骨質疏松癥發生的主要機制之一［1-2］。近年來，應用中藥的活性成份調節成骨細胞分化，進而達到防治骨質疏松癥的目的越來越受到人們的重視，如淫羊藿苷、丹參酮-ⅡA和骨碎補等［3-5］。葛根素作為中草藥葛根的活性成分，能增加成骨細胞的增殖和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的活性、促進礦化結節的形成，促進機體骨密度和骨礦物質含量增加［6］。本課題組前期研究［1，7-8］發現，葛根素能夠抑制糖皮質激素誘導的成骨細胞凋亡，同時抑制破骨細胞的分化。

自噬是維持細胞正常代謝必需的一個生理過程［9］。自噬與骨質疏松癥關聯密切，敲除自噬關鍵基因的模型大鼠骨量下降，發生骨質疏松癥［10］。自噬缺乏的成骨細胞礦化能力降低［11］，提示自噬在骨形成和成骨細胞分化過程中發揮重要的調節作用。

葛根素能夠促進成骨細胞的分化及礦化，但是其作用機制目前還不完全清楚。本研究擬探討自噬在葛根素調節成骨細胞分化過程中的作用，為葛根素應用于臨床防治骨質疏松癥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：hFOB1.19人成骨細胞（美國ATCC公司）。

1.1.2 試劑：葛根素（中國狄爾格生物醫藥公司，溶于DMSO，儲存濃度1×10-5mol/L，-20 ℃保存）；進口胎牛血清（美國Hychone公司）；BCIP/NBT ALP顯色試劑盒（中國Beyotime公司），茜素紅S（美國Sigma公司），免疫熒光染色試劑盒、山羊抗兔、山羊抗鼠二抗HRP（美國Abcom公司），Cy3標記的二抗（中國Beyotime公司）；Runt相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX 2），骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、微管相關蛋白輕連3-Ⅱ/Ⅰ（microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ/Ⅰ，LC3-Ⅱ/Ⅰ）、BECLIN 1一抗（美國Abcom公司）；G418（美國Sigma公司）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）。

1.1.3 儀器：細胞孵箱（日本Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；免疫熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；AMR-100酶標儀（中國杭州奧盛儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 hFOB1.19成骨細胞培養、誘導分化及分組：

1.2.1.1 未分化的成骨細胞培養 未分化的成骨細胞培養基含DMEM/F-12、10%胎牛血清、0.3 g/L G418，孵箱培養條件為5%CO2、33 ℃。

1.2.1.2 誘導分化培養 分化培養基是在未分化培養基的基礎上，加入β-甘油磷酸（5×10-3mol/L），抗壞血酸（0.1 g/L），維生素K（10-8mol/L ），1，25-二羥維生素D3［1，25（OH）2D3］（10-7mol/L），孵箱培養條件為5%CO2，39.4 ℃。

1.2.1.3 分組 將成骨細胞分為3組，即A組（成骨分化誘導），B組（成骨分化誘導+10-8mol/L葛根素3 h），C組（成骨分化誘導+10-8mol/L葛根素3 h+5 mmol/L 3-MA 1 h）。

1.2.2 ALP分析：細胞分組處理后，PBS洗滌3次，用95%乙醇固定細胞10 min，晾干，按照碧云天的BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒所提供的相應操作步驟進行染色分析，晾干拍照。

1.2.3 茜素紅染色：細胞（1×105/孔）接種于24孔板內生長致融合，分組處理后75%乙醇固定和1%的茜素紅S染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 免疫熒光染色檢測成骨分化過程中LC3Ⅰ/Ⅱ的蛋白表達：將圓形的多聚賴氨酸載玻片至于6孔板內，細胞接種于多聚賴氨酸載玻片上24 h。分組處理后，用免疫染色固定液固定爬片10 min，免疫染色洗滌液洗玻片3次，每次3 min，封閉液封閉60 min；一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。去除一抗，加熒光二抗，濕盒中37 ℃孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5 透射電鏡觀察：細胞經分組處理后消化、離心，去上清，將離心管中的細胞團塊取出移入1.5 mL的EP管內，在4 ℃用PBS漂洗3次，每次10 min。再用1% 四氧化鋨在4 ℃固定15～30 min，接著用PBS漂洗3次。丙酮溶液梯度脫水后浸透，吸棄瓶中脫水劑，加3 mL純丙酮-EPON812包埋劑（1 ∶1體積比），室溫下放置30 min后，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1 mL，室溫放置2 h或過夜。將預先干燥的EPON明膠囊注滿混合包埋劑，倒蓋在單層細胞上，在60 ℃固化24 h。超薄切片，采用JEOL 2000FX透射電子顯微鏡觀察。對自噬性溶酶體空泡樣量化，自噬性溶酶體空泡樣的計數在每個領域和標準化的表面積（n＞ 3）。

1.2.6 Western blotting檢測：加入裂解液提取細胞蛋白，冰上放置40 min，4 ℃ 12 000 r/min離心40 min，取上清，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白樣品，于10%聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE，電泳結束后100 V電轉印至PVDF膜。將PVDF膜放入封閉液中37 ℃封閉1 h，加入稀釋一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的稀釋二抗孵育，37 ℃震搖1 h，洗膜。ECL發光法曝光成像，掃描入電腦（n＞ 3）。

1.3 統計學分析

采用 SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據以表示，組間比較采用ANOVA方法，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 葛根素促進成骨細胞分化

不同濃度的葛根素（10-6、10-7、10-8mol/L）處理誘導分化組細胞3 h后，都可見不同程度的促成骨細胞分化作用。結果顯示，未處理組細胞ALP染色陽性面積約占視野的40%，10-6mol/L葛根素組ALP染色陽性面積約占視野的55%，10-7mol/L葛根素組ALP染色陽性面積約占視野的65%，10-8mol/L葛根素組ALP染色陽性面積約占視野的80%以上，見圖1。葛根素在10-8mol/L濃度時促成骨細胞分化效果最明顯（P=0.002），因此，本研究選用該濃度進行后續實驗。

圖1 葛根素促進成骨細胞分化 ×40Fig.1 Puerarin promotes osteoblast differentiation ×40

2.2 3-MA抑制葛根素的促進成骨細胞分化

ALP染色結果顯示，非誘導組細胞分化不明顯，A組細胞開始成骨細胞分化，ALP染色陽性面積約占視野的30%。B組成骨細胞分化效果顯著提升，ALP染色陽性面積約占視野的80%（P=0.004），C組成骨細胞分化程度明顯高于對照組（P=0.021），但明顯低于葛根素處理的B組，ALP染色陽性面積約占視野的50%，見圖2。

圖2 3-MA抑制葛根素促進成骨細胞分化作用 ×40Fig.2 Inhibition of puerarin’s osteogenic effect by 3-MA ×40

2.3 葛根素促進成骨細胞礦化

茜素紅染色結果顯示，A組細胞有鈣化結節的形成，茜素紅染色陽性面積約占視野的25%。B組鈣化結節的形成更加顯著（P=0.012），茜素紅染色陽性面積約占視野的50%。C組促成骨細胞分化受到抑制（P=0.034），茜素紅染色陽性面積約占視野的30%，見圖3。

圖3 葛根素促進成骨細胞礦化 ×40 Fig.3 Puerarin promotes osteoblast mineralization ×40

2.4 葛根素促進成骨細胞分化過程中自噬體的形成

A組有少量自噬體形成，B組自噬體形成較A組增多（P=0.002）。C組用3-MA自噬抑制劑處理后，自噬體明顯減少，在自噬受到抑制的同時，葛根素的促成骨細胞分化效果也受到抑制（P=0.024），見圖4。

圖4 葛根素促進成骨細胞分化過程中自噬體的形成Fig.4 Puerarin promotes autophagy during osteoblast differentiation

2.5 葛根素促進LC3-Ⅱ蛋白表達

免疫熒光染色結果顯示，未加葛根素處理時，LC3-Ⅱ散在分布于細胞質中，加入葛根素后，LC3-Ⅱ增多并在細胞核周圍累積（染色紅色），說明LC3-Ⅱ的表達和分布通過葛根素給藥明顯放大。用3-MA自噬抑制劑（5 mm，1 h）處理后，LC3-Ⅱ表達減少，見圖5。

圖5 葛根素促進LC3-Ⅱ蛋白表達 Fig.5 Puerarin promotes LC3-Ⅱ protein expression

2.6 葛根素促進成骨細胞分化相關蛋白表達

Western blotting結果顯示，成骨細胞分化過程中，A組OPG、RUNX 2蛋白表達略增加，B組OPG、RUNX 2蛋白表達明顯增加（P=0.012和P=0.38）。C組葛根素的促成骨細胞分化作用被明顯減弱，其蛋白表達與A組相似。提示葛根素在促進成骨細胞分化過程中，成骨細胞分化相關蛋白發揮了重要的調節作用，見圖6。

圖6 葛根素促進成骨細胞分化相關蛋白表達Fig.6 Puerarin promotes autophagy during osteoblast differentiation

2.7 葛根素促進成骨細胞分化過程中自噬相關蛋白表達

A組LC3-Ⅱ蛋白的表達略有增加（P=0.001），B組LC3-Ⅱ的表達顯著增加。BECLIN 1在自噬開始的信號傳導中起重要作用，與A組相比，B組BECLIN 1的表達也顯著增加（P=0.004）。C組葛根素的促成骨細胞分化作用被明顯減弱，自噬相關蛋白表達亦減弱。提示在葛根素促進成骨細胞分化過程中，自噬發揮了重要的調節作用（P=0.014和P=0.028），見圖7。

圖7 葛根素促進成骨細胞分化過程中自噬相關蛋白表達Fig.7 Puerarin promotes expression of autophagy-related proteins during osteoblast differentiation

3 討論

骨質疏松癥的發病過程中伴隨著成骨細胞和破骨細胞的數量和活性的不平衡［12］。其中，成骨細胞的分化能力降低是導致骨質疏松癥的主要原因之一。成骨細胞是骨形成的主要細胞，因此，增加成骨細胞的分化能力是防治骨質疏松癥的主要策略［13］。前期相關研究［14］發現，葛根素能夠促進成骨細胞的分化。但是，葛根素對成骨細胞分化的影響以及自噬在成骨細胞分化過程中的作用目前還不清楚。

自噬參與骨組織的代謝過程，適當水平的自噬使成骨細胞能夠存活于低氧、營養缺乏甚至高滲的環境［15］。此外，自噬在維持骨穩態方面起著至關重要的作用，與骨質疏松癥的發生密切相關［11］。研究［16-17］表明，自噬相關蛋白參與成骨細胞分化、礦化和骨形成。敲除FIP200（參與組成fip200-atg13-ulk1復合體）的基因鼠模型中，由于骨形成嚴重減少導致骨質疏松癥的發生，導致成骨細胞多種自噬缺陷，包括p62的過表達、LC3-Ⅱ 的轉換不充分、自噬流的缺乏等，影響骨的形成［18-19］。敲除自噬相關基因7可導致大鼠松質骨的骨量和皮質骨的厚度下降，皮質骨孔隙度增加，誘導骨質疏松癥的發生［20］。

本研究結果表明，成骨細胞在分化過程中表現出一定的基礎自噬水平，葛根素在促進成骨細胞分化的同時，也明顯增強細胞的自噬能力，表現為細胞內自噬小體的數量增加和自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ和BECLIN 1的表達增強。同時還發現，加入自噬抑制劑3-MA后，葛根素的促成骨細胞分化作用受到明顯抑制，說明自噬在葛根素促進成骨細胞分化的過程中扮演著重要的角色，葛根素可能通過自噬調節成骨細胞分化。

本研究深入分析了自噬在葛根素促成骨細胞分化中的分子生物學作用，明確了葛根素通過自噬調節成骨細胞分化潛在的機制，為臨床應用中藥單體防治骨質疏松癥提供理論基礎及實驗依據。