基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)三七治療缺血性腦卒中的作用機制研究

伍海軍，吳靜瀾，楊欣，楊華，潘政，陳永順

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)1.第一附院醫(yī)院神經(jīng)外科，貴陽 550001；2.藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，貴陽 550025）

研究［1-2］顯示，腦卒中發(fā)病率、致殘率、死亡率均較高。其中缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）的發(fā)病率最高，占腦卒中60%～70%［3-4］。目前CIS主要采用中西醫(yī)藥物治療，目的是修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，避免血小板之間聚集和黏附，并通過抗凝、調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)平衡等機制改善腦循環(huán)，保護腦神經(jīng)元。研究［4-5］證實，CIS不論是急性期還是恢復(fù)期采用中藥治療都能顯著改善神經(jīng)功能。

三七總皂苷通過改善能量代謝障礙，抑制血小板聚集、降低血小板黏附等作用減少細胞損傷［5］。目前，對三七治療CIS方面研究大多在單體和復(fù)方上，而三七成分復(fù)雜，治療作用的相關(guān)機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是依托系統(tǒng)生物學(xué)，通過使用生物網(wǎng)絡(luò)技術(shù)來闡述“藥物-基因-靶點-疾病”之間復(fù)雜關(guān)聯(lián)的一門學(xué)科［6］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討三七治療CIS有效化學(xué)成分、靶標基因及相關(guān)的信號通路，為闡明三七治療CIS的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 三七活性成分獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn）檢索獲取三七化學(xué)成分相關(guān)信息，三七活性成分納入標準：（1）口服吸收度（oral bioavailability，OB）＞30%；（2）類藥（drug-likeness，DL）＞0.18［5-6］。

1.2 靶標基因獲取

1.2.1 三七活性成分靶標基因獲取：采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn）獲取三七活性成分靶標蛋白。通過UniProtKB數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）檢索活性成分獲得靶標蛋白名稱，同時獲取靶標蛋白基因及其通用蛋白質(zhì)知識庫（universal protein knowledge base，UNIPROTKB）的通用蛋白標識（universal protein identification，UPID）。

1.2.2 CIS靶標基因獲取：以“ischemic stroke”為關(guān)鍵詞，檢索 DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/）來獲取CIS靶標基因。

1.2.3 三七治療CIS的靶標基因獲取：采用Excel 2010篩選出三七活性成分靶標基因和CIS靶標基因的交集基因作為三七治療CIS的靶標基因（簡稱為作用靶標基因），同時篩選出該基因?qū)?yīng)的UPID。

1.3 有效成分-作用靶標基因網(wǎng)絡(luò)建立

將作用靶標基因和三七活性成分相關(guān)關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件系統(tǒng)中分析，構(gòu)建有效成分-作用靶標基因網(wǎng)絡(luò)。

1.4 重要信號通路和分子功能獲取

將作用靶標基因?qū)雝he Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery（DAVID）數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），獲得京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路、基因腫瘤學(xué)（gene oncology，GO）分類富集分析結(jié)果。選取P＜ 0.001的分子功能以及信號通路，從中篩選出排名前20位的分子功能以及信號通路。

1.5 有效成分-作用靶標-信號通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇富集三七治療CIS有效成分-CIS靶標基因的作用靶標，與作用靶標基因比較來篩選出交集靶標。將這些交集靶標與有效成分-作用靶標基因網(wǎng)絡(luò)進行配對，然后將匹配的關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件系統(tǒng)中，構(gòu)建有效成分-作用靶標-信號通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 三七活性成分的篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，共獲得三七化學(xué)成分119個，符合本研究納入標準的活性成分5個，包括β-谷固醇、豆甾醇、槲皮素、人參皂苷rh2、三七皂苷r1，見表1。

表1 三七活性成分Tab.1 Active components of Sanqi

2.2 作用靶標基因的篩選結(jié)果

把5個活性成分在DRAR-CPI服務(wù)器中反向?qū)拥玫?47個靶標基因（Z＜ -0.5）；將上述靶標基因與GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中的CIS標靶基因進行比對，獲得96個作用靶標基因，見表2。

表2 作用靶標基因篩選結(jié)果Tab.2 Screening results of the target genes

2.3 有效成分-作用靶標基因的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

結(jié)果顯示，5個有效成分和96個作用靶標基因的節(jié)點數(shù)為101，134條邊線表示兩者之間存在134種關(guān)系，其中83個作用靶標基因與槲皮素相互有作用關(guān)系。說明三七的有效成分可以對應(yīng)相同或不同的作用靶標基因，可見三七治療CIS具有多成分、多靶標的特點。見圖1。

圖1 有效成分-作用靶標基因網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The network of the effective components -target gene

2.4 核心靶標的篩選結(jié)果

通過String數(shù)據(jù)庫繪制出靶標的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，邊線1 187條、節(jié)點96個，見圖2。使用Network Analyzer工具計算得到靶標連接度結(jié)果顯示，連接度最高的5個靶標是蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、c-JUN蛋白（C-jun protein，c-JUN）、肝磷脂結(jié)合表皮生長因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF），因此認為這5個靶標就是核心靶標。

圖2 作用靶標的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The interaction network of the targets

2.5 重要信號通路和分子功能的篩選結(jié)果

KEGG通路和GO分類富集分析結(jié)果顯示，前20位信號通路或分子功能見表3。經(jīng)過查閱文獻［7-8］，認為低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor -1，HIF-1）、磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/ protein kinase B，PI3K/AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是三七治療CIS的重要信號通路。

表3 作用靶標的KEGG通路富集分析結(jié)果Tab.3 Enrichment analysis results of the target by the KEGG pathway

2.6 有效成分-作用靶標-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

結(jié)果顯示，有效成分-作用靶標-信號通路網(wǎng)絡(luò)共49個節(jié)點，三七治療CIS的機制為5個有效成分作用于41個作用靶標，調(diào)控3個重要信號通路來發(fā)揮保護缺血損傷、抗炎等作用。見圖3。

圖3 有效成分-作用靶標-信號通路網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The network about effective component-target-signaling pathway

3 討論

研究［7］顯示，中藥三七具有通脈行瘀以及止血效果。三七通過改善內(nèi)皮功能顯著抑制血小板的活化作用，從而降低血液黏度，有效預(yù)防血栓的形成。已有研究［8］證明三七具有抗氧化、抗粥樣硬化斑塊形成以及抗炎的效果，治療動脈粥樣硬化療效顯著。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā)構(gòu)建了三七有效成份-作用靶標-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果顯示，三七治療CIS的5個有效成分作用于41個靶標基因，從而對CIS產(chǎn)生治療效果。既往研究［9］指出腦細胞能量代謝紊亂和凋亡過程與槲皮素關(guān)系密切，槲皮素對腦血管疾病的治療發(fā)揮著積極作用。本研究結(jié)果顯示槲皮素作用于34個靶標基因，與以往研究結(jié)果一致。

張珊珊等［10］也證實了阻斷PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，大鼠p-AKT1蛋白表達顯著減少，顯著影響血管再生。本研究對KEGG通路以及GO分類富集分析的結(jié)果顯示，三七治療CIS的機制為5個有效成分作用于41個作用靶標，調(diào)控HIF-1、PI3K/AKT、MAPK信號通路來發(fā)揮保護缺血損傷、抗炎等作用。可見三七治療CIS的過程涉及多個活性成分、作用靶標及通路，與中藥治療疾病“多成分、多靶標、多通路”的作用特點相符合。

綜上所述，三七通過自身有效成分作用多個靶標基因來治療CIS，其作用機制可能是通過信號通路獲得非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)藥理調(diào)節(jié)來完成的。本研究從理論層面研究了三七治療CIS的作用機制，今后還需要相關(guān)細胞、分子實驗及更多的臨床研究進一步論證。