“分解纖維素的微生物的分離”教學(xué)設(shè)計*

王 平 （佛山市南海區(qū)第一中學(xué) 廣東佛山 528200）

《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》提出教學(xué)過程重實踐，要讓學(xué)生積極參與動手和動腦的活動。“分解纖維素的微生物的分離”實驗耗時長，涉及的器材和技術(shù)較多，本設(shè)計通過培訓(xùn)興趣濃厚、動手能力強的學(xué)生，指導(dǎo)組員完成實驗，充分調(diào)動全體學(xué)生參與的積極性。在實施過程中，教師重視引導(dǎo)學(xué)生主動思考，通過探究活動加深對概念的理解，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維和科學(xué)探究能力。

1 教材分析

“分解纖維素的微生物的分離”是人教版選修1 專題2 課題3 的內(nèi)容，是在學(xué)習(xí)了微生物培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識和基本的操作技能、對特定的微生物的分離計數(shù)和鑒定、鑒別培養(yǎng)基的配制和作用的基礎(chǔ)上，增加了鑒別培養(yǎng)基的知識及其應(yīng)用。因此，本節(jié)內(nèi)容是對本專題相關(guān)基礎(chǔ)知識和操作技能的進(jìn)一步強化，起鞏固和提高的作用。本節(jié)課內(nèi)容主要包括兩大部分：1）纖維素與纖維素酶；2）纖維素分解菌的分離，計劃分2 課時完成。全國Ⅰ卷選修1 部分2014年卷考查了剛果紅染色的基本原理和纖維素酶、培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，2017年、2018年主要考查了鑒別培養(yǎng)的原理，可見本節(jié)內(nèi)容涉及的基本知識和能力在高考中具有重要地位。

2 教學(xué)目標(biāo)

1）生命觀念：從穩(wěn)態(tài)與平衡觀出發(fā)，闡明如何利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶分解造紙廢水中的纖維素，解決造紙廢水治理問題。

2）科學(xué)思維：通過比較、分析與綜合等方法，對實驗過程中的現(xiàn)象和結(jié)果進(jìn)行解釋、推理，并作出合理的判斷。

3）科學(xué)探究：作出假設(shè)和預(yù)期，確認(rèn)變量，設(shè)計可行的實驗方案，對結(jié)果進(jìn)行合理解釋。

4）社會責(zé)任：關(guān)注生物學(xué)原理和技術(shù)在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用。

3 教學(xué)重、難點

設(shè)計實驗從土壤中分離分解纖維素的微生物。

4 教學(xué)策略

采用“探究式教學(xué)方法”，以學(xué)生為中心，教師從生產(chǎn)實踐實例導(dǎo)入，通過提出問題、分析現(xiàn)象、設(shè)計方案、指導(dǎo)操作，在探究的過程中培養(yǎng)學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。將全班學(xué)生分為6 組，各組選出1 位組長，負(fù)責(zé)指導(dǎo)和督促組員規(guī)范操作。

5 教學(xué)過程

5.1 情境引入 造紙廠排出的工業(yè)廢水中含有大量纖維素等其他雜質(zhì)，若不經(jīng)處理任意排放，會對水體造成極大的危害。如何通過生物方法分解廢水中的纖維素？學(xué)生回答：通過纖維素酶的降解。教師引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材第27 頁“纖維素與纖維素酶”相關(guān)知識。土壤中存在能產(chǎn)生纖維素酶的微生物，從中篩選出高效纖維素降解菌，對造紙廢水進(jìn)行生物處理及纖維素資源的再利用具有非常重要的意義[2]。要求學(xué)生預(yù)習(xí)教材，約定時間于校外香蕉林集中采集土樣。

5.2 采集土樣 引導(dǎo)學(xué)生觀察取樣地附近環(huán)境，提問：為了成功分離出土壤中的纖維素分解菌，取樣地的環(huán)境應(yīng)具備哪些特點？是采集香蕉林的土樣，還是附近菜地的土樣？若在香蕉林采集土樣，選擇何種土樣更好？是落葉多的還是落葉少的？

學(xué)生交流得出：根據(jù)生物與環(huán)境相適應(yīng)的原理，應(yīng)采集香蕉林多年落葉形成的腐殖土，易于分離出目的菌。采樣點的環(huán)境見圖1。采樣當(dāng)日指導(dǎo)組長進(jìn)行稱量土壤、梯度稀釋的操作。

圖1 采集土樣點的環(huán)境

5.3 預(yù)實驗確定實驗方案

提問1：如果土樣中的相關(guān)微生物較少，采取何種措施增加目的菌體濃度，以確保能從樣品中分離到所需微生物？選擇培養(yǎng)基的特點是什么？

教師展示第1 次預(yù)實驗結(jié)果：將選擇培養(yǎng)2 d后的菌液進(jìn)行梯度稀釋，用10-5土壤稀釋液涂布，培養(yǎng)2 d 后平板上菌落密布，染色后觀察不到明顯的透明圈（圖2）。從該平板上隨機挑取4 個菌落再次接種到鑒別培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1 d 后，染色結(jié)果見圖3。

圖2 10-5 土壤稀釋液涂布后平板染色結(jié)果

圖3 第1 次預(yù)實驗結(jié)果

提問2：預(yù)實驗出現(xiàn)了上述結(jié)果，說明了什么？該如何改進(jìn)實驗方案？

小組交流討論，得出本組意見。全班討論后明確：1）可通過選擇培養(yǎng)提高纖維素分解菌的濃度。選擇培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，以纖維素粉為唯一碳源。2）圖2 中的菌落再次接種至鑒別培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)染色后可觀察到透明水解圈（圖3），說明產(chǎn)生透明圈的菌落是可分解纖維素的，利用這種方法可從土樣中獲得分解纖維素的微生物。

教師展示第2 次預(yù)實驗結(jié)果（圖4），并作說明：第2 次預(yù)實驗省略了選擇培養(yǎng)這一步驟，其他與第1 次預(yù)實驗相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-6～10-4土壤稀釋液涂布染色后均可見明顯的透明圈。因此，全班的正式實驗可省略選擇培養(yǎng)這一步。

圖4 第2 次預(yù)實驗結(jié)果

5.4 實驗教學(xué)過程

5.4.1 倒平板 每組成員在組長的指導(dǎo)下各倒1個平板備用。

5.4.2 梯度稀釋 各組組長在全班演示梯度稀釋的過程及注意事項，由其他組學(xué)生評價其操作是否規(guī)范。

5.4.3 組織討論并涂布平板 各組閱讀教材并針對下列問題進(jìn)行交流討論，總結(jié)本組意見，完成涂布操作。

問題1：根據(jù)預(yù)實驗經(jīng)驗，選取10-6～10-4土壤稀釋液進(jìn)行涂布，每個梯度至少涂布幾個平板？如何設(shè)置對照？

問題2：鑒別培養(yǎng)基的特點是什么？纖維素分解菌的鑒別原理是什么？

全班討論后明確：1）每個梯度至少需要涂布3 個平板，對照組涂布等量無菌水代替。2）鑒別培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，以纖維素為主要碳源，對纖維素分解菌具有選擇作用，也屬于選擇培養(yǎng)基。剛果紅可與纖維素形成紅色復(fù)合物，但不與纖維二糖、葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，就無法形成剛果紅-纖維素的復(fù)合物，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，可通過是否產(chǎn)生透明圈篩選纖維素分解菌。教材提供的鑒別培養(yǎng)基中還含有淀粉類物質(zhì)，能產(chǎn)生淀粉酶的微生物可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

5.4.4 培養(yǎng)并進(jìn)行階段性評價 第1 課時結(jié)束，將全班涂布的平板和空白對照平板置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。組長從預(yù)習(xí)認(rèn)真程度、實驗操作規(guī)范程度等方面評價組員的表現(xiàn)。

5.4.5 組織討論并進(jìn)行染色實驗 在學(xué)生進(jìn)行剛果紅染色和NaCl 脫色操作時，利用等待的時間，讓學(xué)生包扎平板、滴管等實驗耗材，準(zhǔn)備5 支裝9 mL 蒸餾水的試管，并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，熟悉高壓蒸汽滅菌鍋的操作方法。

問題1：在實驗中如何判斷制作的培養(yǎng)基是否合格？鑒別培養(yǎng)基上長出的菌落形狀、大小、隆起程度和顏色是否一致？

問題2：教材提供了2 種剛果紅染色法，2 種方法各有哪些優(yōu)、缺點？

問題3：若要篩選出分解纖維素能力最強的菌落作為處理造紙廢水的菌種，采用什么方法比較不同菌落分解纖維素的能力？

問題4：如何定量測定不同菌落產(chǎn)生的纖維素酶的酶活力？如何對篩選出的菌種進(jìn)行凍存？

學(xué)生完成染色、脫色后，對上述問題分小組討論并形成本組意見。全班交流得出：1）對照組的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長說明培養(yǎng)基制作合格。由于本實驗是從土壤中篩選分解纖維素的微生物，不是單一菌種，因此，菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色可能會不一致（圖5）。2）方法1 的缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；優(yōu)點是這樣顯示的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法2 的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題；缺點是有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅，形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分[3]。3）纖維素分解菌的篩選中，透明圈大的菌落，纖維素酶活力未必高，因此，應(yīng)比較各組分離出的纖維素分解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值，比值越大的菌落，分解纖維素的能力越強。

圖5 學(xué)生的實驗結(jié)果

教師介紹問題4 的操作：1）纖維素酶活力測定方法。用濾紙等纖維素作為底物，在50℃恒溫水浴下，經(jīng)纖維素酶水解0.5 h 后生成葡萄糖，然后用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosaliclic acid，DNS）法測定葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖的量比較酶活力大小[4]。2）用滅菌牙簽挑出產(chǎn)纖維素酶能力強的菌落至液體培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)1～2 d 后，將滅菌甘油與菌液等比例混合于1.5 mL 塑料離心管中，-20℃保存。教師可指導(dǎo)組長將篩選到有透明圈的菌落用滅菌牙簽轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖6）。若條件許可，還可開展凍存、測酶活力、顯微鏡下觀察菌株菌絲及孢子形態(tài)對其進(jìn)行生物多樣性分析的拓展實驗[4]。

圖6 纖維素分解菌經(jīng)剛果紅染色后形成的透明圈

師生共同總結(jié)：這2 節(jié)課圍繞纖維素分解微生物處理造紙廢水，以從土壤中分離分解纖維素的微生物為目的，進(jìn)行實驗設(shè)計，篩選出能分解纖維素的菌落，并對其產(chǎn)酶能力進(jìn)行了初步比較。通過實驗操作和交流，掌握了土壤取樣的注意事項、選擇培養(yǎng)的目的、染色的注意事項及分離培養(yǎng)微生物的一般方法。

6 反思

教學(xué)設(shè)計以培養(yǎng)科學(xué)思維和科學(xué)探究能力為目的，引導(dǎo)學(xué)生善于運用生物學(xué)知識對生物學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行思考和解釋，體悟科學(xué)研究的過程、方法與思維方式，能科學(xué)精準(zhǔn)地進(jìn)行語言交流。分小組進(jìn)行實驗教學(xué)，提前培訓(xùn)小組長，不僅使他們對學(xué)到的知識印象深刻，而且提高了解決問題的能力和責(zé)任心，由此產(chǎn)生較高的成就感和自信。組長對組員的指導(dǎo)和監(jiān)督、組員組長間的互評、合作和交流等措施，對于班級整體實驗探究能力的提升具有較好的促進(jìn)作用。