基于問題解決的“蛋白質工程的原理和應用”教學設計

王岳瓊 白建秀

（1 北京中學 北京 100028 2 北京朝陽區教育研究中心 北京 100124）

問題解決是以問題引導的方式，促進學習者的思維發展的教學模式[1]。基于解決真實問題的教學，在解決問題過程中獲取知識，形成概念，有利于培養學生的問題意識，提高學生解決問題的能力。在“蛋白質工程的原理和應用”一節的教學中，設計利用纖維素酶改造的過程設置真實問題，引導學生在解決問題中提升科學素養。

1 教學內容分析與設計思路

蛋白質工程是在基因工程的基礎上，實現對蛋白質進行改造的工程技術。這部分內容既聯系學生前期所學的蛋白質與基因之間的關系，又涉及具體的分子、細胞水平的操作技術。學習本部分內容有利于學生將前、后所學知識聯系成體系，理解科技與現實生活的緊密聯系。

在真實的科研問題情境中，學生在學習中不斷地經歷提出問題、解決問題、出現新問題、再解決問題的過程，有利于其習得新的生物學知識，養成科學思維習慣。

本設計以生產中纖維素酶改造遇到的真實問題為例，引導學生利用所學知識解決問題，同時形成蛋白質工程的概念，并體會科技水平的進步對現實生活的影響。在學習纖維素酶改造的過程中，形成“蛋白質工程是基因工程的延伸”這一概念。

2 教學目標

1）用結構與功能觀和信息觀，概述利用基因工程原理設計和改造蛋白質獲得性狀和功能更符合人類需求的基本思路或流程。

2）在給定情境或解決問題的過程中，能基于事實和證據運用歸納與概括、批判性思維等方法，比較基因工程與蛋白質工程的區別與聯系。

3）針對人類生產、生活的某一需求，嘗試提出初步的工程學構想，并進行簡單的設計。

4）認同蛋白質工程是一項難度很大的工程，目前已展示出誘人的前景并將給人類帶來更多的福祉；運用蛋白質工程原理對原有蛋白質結構進行基因改造、生產目標蛋白，參與科學問題的討論。

3 教學過程

3.1 創設情境，引入新課 纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖有機物。利用廉價的纖維素材料生產生物基產品和生物能源，可緩解世界范圍內日益突出的糧食和能源短缺問題，對人類的可持續發展具有重要意義[2]。學生已知構成纖維素的單體是葡萄糖。教師介紹葡萄糖構成纖維素的方式——纖維素中的葡萄糖之間通過β-1，4 糖苷鍵連接，以及纖維素在生產、生活中的應用。纖維素酶可分解纖維素。Zhang 等[2]總結了纖維素酶的作用機理（圖1）。

圖1 纖維素酶的作用機理[2]

分析圖1 可知，纖維素酶包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶在發揮催化功能時，切斷纖維素的β-1，4 糖苷鍵，產生纖維二糖、纖維糊精等產物。之后，β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖。

教師介紹上述內容，為學生后續學習纖維素酶的改造作鋪墊。

3.2 發現問題，探明究竟 教師指出，實際應用時發現，在催化纖維素分解的過程中，酶的活性會下降。提問：引起酶活性下降的原因是什么？

學生的討論主要集中在以下3 個方面。1）可能是纖維素混有的雜質抑制了酶的活性。2）可能是酶與纖維素反應過程中沒有充分混合均勻，導致糖的產量隨時間推移而下降，而被誤認為是酶活性下降。3）可能是產物抑制了酶的活性。

教師講解：通過研究人員的實驗，發現產物纖維二糖會抑制葡聚糖酶的催化活性，從而限制從生物體中提取纖維素酶直接用于生產。提問：如何找出纖維二糖抑制酶活性的原因？

學生討論：因為酶的結構決定其功能，所以，可能是纖維二糖與酶的相互作用改變了酶的結構，從而降低了酶的活性。可通過研究纖維素酶的結構，探索纖維二糖和纖維素酶之間的相互作用。

教師介紹：外切葡聚糖酶是蛋白質，是由氨基酸脫水縮合形成的肽鏈構成的，肽鏈盤曲、折疊，形成有一定空間結構的蛋白質分子。圖2 是外切葡聚糖酶的結構簡圖，外切葡聚糖酶分為催化區域、纖維素結合區域及二者的連接區。

圖2 外切葡聚糖酶的結構[2]

外切葡聚糖酶在發揮作用時，利用纖維素結合區域與纖維素的多糖鏈結合。然后，催化區域切斷纖維素的β-1，4 糖苷鍵，產生纖維二糖、纖維糊精等產物。如圖3 所示，水解出的纖維二糖會與酶催化區域的第248 位的精氨酸和第385 位酪氨酸的側鏈基團發生相互作用，形成封閉結構，阻礙了纖維二糖的釋放，繼而抑制酶的催化活性，從而出現產物抑制酶活性的現象。

圖3 外切葡聚糖酶的催化區域的結構[3]

3.3 尋找出路，實驗求證 教師提問：如何解除纖維素降解產物纖維二糖對外切葡聚糖酶活性的抑制？

學生討論并提出解決思路：及時清除反應的產物纖維二糖；或通過直接改變酶的某些基團，或改造相應基因等方法，調整酶與產物的相互作用。結合學生的討論，教師提問：蛋白質是由氨基酸構成的，如何改變蛋白質中的氨基酸？如何確定針對纖維素酶基因序列中哪幾個堿基進行操作？

研究人員利用PCR 等技術手段，對纖維素酶催化區域的編碼基因進行改造。例如，通過查閱密碼子表，知道UAC 是酪氨酸對應的一種密碼子，結合中心法則的堿基互補配對關系，可推測出相應的基因中對應堿基排序為ATG/TAC。可將DNA 上的堿基由ATG/TAC 變為CGG/GCC，改變了基因序列中的2 個堿基對，從而可將第385 位的酪氨酸變為丙氨酸。將改造成功的基因轉入受體細胞，可生產出改造后的蛋白質。新合成的纖維素酶與纖維二糖不再形成上述封閉結構，使得纖維二糖可順利地從酶的催化結構區域釋放，解除了產物的抑制作用，并通過實驗再次檢測改造后的效果（圖4，Y385A 為改造后的突變體）。

圖4 纖維二糖對酶的抑制作用比較[3]

上述解決纖維二糖的產物抑制問題時采用的方法，稱為理性蛋白質設計方案（圖5）。這一方案是根據對蛋白質功能的預期，結合蛋白質的結構與功能的關系，對蛋白質結構進行設計，再通過定點突變技術，改造相應基因，并將基因導入到微生物細胞中表達出新的蛋白質。多次重復上述過程，最終可獲得期待的蛋白質。

圖5 理性蛋白質設計方案[2]

利用此法是否可完美地改造蛋白質？教師提供另一組實驗數據（圖6）。

可用總糖釋放量衡量酶的活性。通過定點突變技術緩解了纖維二糖對酶的抑制作用，但因為酶結構的改變，導致改造后酶的活性與野生型相比有一定程度的降低。雖然此法沒有顯著提高酶的活性，但卻使學生對纖維素酶催化區域內部氨基酸之間的相互作用關系及其與酶功能的關系有了進一步的了解，可在這一研究的基礎上繼續對酶進行改造。

通過改造纖維素酶的實例，學生體會到蛋白質結構和功能的關系，理解科學研究是在不斷地提出問題、解決問題、再提出問題過程中進步的。

結合這一實例，師生總結理性設計蛋白質改造方案的優、缺點。理性設計改造蛋白質，基于可從結構預測功能這一科學知識。利用此法可通過改造基因，精確地改造蛋白質。但自然界中不同種類纖維素酶的編碼基因差異較大，而相應的酶功能卻差別不大。此外，目前的研究顯示，蛋白質不但在數量上遠超基因，而且蛋白質的可變性和多樣性，導致對蛋白質的研究較核酸更復雜和困難。對蛋白質分子結構的設計還有很多知識和經驗需要積累。目前，未精確了解蛋白質的結構及結構與功能的關系，即進行定點突變的方案設計，難度較大，成功率不高。然而，有時定點突變雖不能得到預期的蛋白質，但定點突變后獲得蛋白質功能或結構的改變，有利于進一步了解蛋白質的氨基酸排序與空間結構的關系、空間結構與蛋白質功能的關系。這一技術可不斷加深對蛋白質結構和功能關系的理解。

根據酶在實際生產中應用遇到的問題，師生共同總結解決方案的思路（圖7）。

通過教師的提問，引導學生將已學的蛋白質結構與功能的關系、基因與蛋白質的關系等基本生物學理論知識應用于實踐。

3.4 又生疑惑，繼續探求 提問：理性設計蛋白質的技術成功率不高，怎樣解決這一問題？學生思考后，教師提供科研實例。

研究人員選用枯草芽孢桿菌的內切葡聚糖酶基因，利用PCR 等方法，獲得突變基因，將獲得的突變基因轉入微生物細胞中，進而構建突變體文庫，合成改造后的蛋白質，再應用剛果紅染色法進行篩選。圖8 展示利用剛果紅染色法比較9 個突變體的纖維素酶降解活力。

圖8 纖維素酶改造的定向進化方案[4]

科研人員具體的做法是，第1 輪得到天然的內切葡聚糖酶基因后，對內切葡聚糖酶基因進行操作，使之發生隨機突變，從3 萬多個克隆的文庫中篩選出14 個比親本透明圈更大的突變體；第2 輪，在第1 輪篩選的基礎上，繼續使用易錯PCR 的方法，從隨機突變體庫約3 萬個克隆中選出11 個透明圈較大的突變體；第3 輪，利用前2 輪隨機突變篩選得到的25 個改良基因，進行基因重組篩選出約1.2 萬個克隆，從中獲得12 個水解活性比親本提高的重組子。

引導學生分析這種方法的基本思路。此方案是模擬自然進化過程。現代生物進化理論的基本內容是：自然界中生物會產生變異，變異方式包括突變和基因重組。通過不定向的變異，產生了多種不同類型的生物。在自然選擇的作用下，具有有利變異的個體有更多的機會遺傳這些變異，而具有不利變異的個體則容易被淘汰。此機制使生物朝著一定的方向不斷進化。

模擬自然進化過程展開的蛋白質改造的方法，稱為蛋白質定向進化方案[2]（圖9）。此法是在對蛋白質的結構及催化機制了解不確切的條件下，預期蛋白質的功能，在體內或體外對原有蛋白質編碼基因進行隨機突變或體外基因重組，構建突變基因庫。之后，將改變后的基因轉入微生物細胞，在微生物細胞中表達出相應的蛋白質。多次重復上述過程，逐漸篩選、得到符合預期功能的蛋白質。上述實例，科研工作者利用蛋白質定向進化方案，最終獲得的纖維素酶水解纖維素的活性較最初的親本提高了2.68 倍。

圖9 蛋白質定向進化方案[2]

教師引導學生評價蛋白質定向進化方案。在對要改造的蛋白分子結構信息并不清楚的條件下，定向進化技術在對纖維素酶進行改造時可能會得到意想不到的“有益收獲”，但操作具有明顯的“盲目性”。假設1 個纖維素酶分子由300 個氨基酸組成，其可能的序列數目將達20300，而其中有益的突變或組合突變會非常少，這使得篩選有效突變體的工作強度非常大，同時極大降低了其改造的有效性。

讓學生深入探討如何克服上述缺點？例如，可構建有效的突變體文庫，建立合理篩選突變體及正確評價各突變體性能的方法等。

教師介紹基于結構生物信息學的纖維素酶結構理性設計。隨著后基因組時代的到來，糖苷水解酶數據庫中收錄的纖維素酶基因序列數目呈現爆炸式增長。蛋白質組學數據的快速增長推動了后基因組時代基于蛋白質家族或基于結構生物信息學的理性設計新策略的形成。其特點是結合了理性設計與定向進化的優勢，通過一定的計算模擬與預測指導纖維素酶的改造。當然，大量信息的共享和計算、模擬、預測方法預期蛋白質結構后，仍然要利用基因工程技術獲得改造后的基因與蛋白質。數據驅動設計與結構生物信息學指導的纖維素酶結構理性設計必將成為后期分子改造的主流方向，也將會為進一步滿足生物能源快速發展的需求提供一定的可能。

3.5 構建概念，總結提升 引導學生總結改造纖維素酶采用的3 種方法技術流程。這3 種方案，均首先預期了蛋白質的功能，之后，根據對蛋白質功能的預期，設計蛋白質的結構，通過蛋白質的氨基酸與基因中堿基的對應關系，改造蛋白質對應的基因；獲得改造的基因后將基因導入到細胞中，得到符合預期的蛋白質。此過程稱為蛋白質工程（圖10）。

圖10 蛋白質工程的技術流程

引導學生從蛋白質工程的理論基礎、實現途徑及目的3 個方面嘗試為蛋白質工程下定義。

蛋白質工程的定義：蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活需求。

師生共同總結蛋白質工程和基因工程的區別和聯系（表1）。

表1 基因工程與蛋白質工程的區別和聯系

3.6 展望 通過蛋白質工程，在生產中改善纖維素酶的性能，降低纖維素酶的生產成本，對于降低生物煉制的加工成本都是至關重要的。科技的進步可將設想逐步變為可實施的現實，為生活提供更大的便利。蛋白質工程在醫學領域、藥物研發領域也取得了很多有價值的研究成果：例如，干擾素體外保存很困難，利用蛋白質工程改造干擾素，如果將其分子上的一個半胱氨酸變成絲氨酸，改造后的干擾素在-70℃條件下可保存半年之久。還可設計自然界中沒有的、全新的蛋白質——這些需要依靠創造力和想象力。

4 反思

本教學設計通過問題引領學生思考纖維素酶的改造方法，形成“蛋白質工程是基因工程的延伸”這一概念。在思考纖維素酶的改造方法、解決實際問題過程中，學生體會科學研究是在提出問題、解決問題、再提出問題、解決問題過程中不斷進步的。在分析改造纖維素酶遇到問題的過程中，讓學生體會蛋白質結構與功能觀、認識到知識的積累、數據的共享在解決實際問題中的重要性，體會科學與技術的關系，同時認識到科技的進步不是一蹴而就的，需要多代人的共同努力。最后列舉實例，使學生體會到科技進步對生活的影響。

在學習本部分內容時，學生經常混淆蛋白質工程和基因工程，認為蛋白質工程就是基因工程。本節教學中，通過分析纖維素酶的改造，學生結合自己所學的蛋白質和基因之間的關系、進化等知識解決問題，并在運用這些知識解決問題過程中，意識到蛋白質工程與基因工程的內在聯系和區別。