某品牌血液分析儀測定全血樣本紅細胞和網織紅細胞新參數穩定性分析

張 輝， 張 馳， 岳道遠

（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，湖北 武漢 430030）

為分析臨床常見癥狀——貧血的原因，XN-20全自動血液分析儀（簡稱XN-20）增加了網織紅細胞（reticulocyte，RET）和紅細胞（red blood cell，RBC）新參數，包括網織紅細胞百分比（the percentage of reticulocyte，RET%）、網織紅細胞絕對值（the absolute value of reticulocyte，RET#）、低熒光網織紅細胞百分比（the percentage of low fluorescent reticulocyte，LFR%）、中熒光網織紅細胞百分比（the percentage of medium fluorescent reticulocyte，MFR%）、高熒光網織紅細胞百分比（the percentage of high fluorescent reticulocyte，HFR%）、未成熟網織紅細胞百分比（the percentage of immature reticulocyte，IRF%）、網織紅細胞血紅蛋白含量（reticulocyte hemoglobin，RET-HE）和小紅細胞百分比（the percentage of microcyte，Micro-R%）、大紅細胞百分比（the percentage of macrocyte，Macro-R%）、低色素紅細胞百分比（the percentage of hypochromic erythrocyte，Hypo-HE%）和高色素紅細胞百分比（the percentage of hyperchromic erythrocyte，Hyper-HE%），這些參數在不同人群貧血分類、RBC活性監測等方面有著重要的應用價值[1-4]。XN-20檢測樣本的準確性與全血樣本的穩定性有關，而穩定性則與存儲條件（時間和溫度）密切相關。楊尚瑜等[5]發現，在體外，RBC外液會緩慢進入細胞內引起滲透性腫脹，隨著樣本放置時間的延長，平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）會增大，平均紅細胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）會降低，而低溫（4 ℃）則會延緩這一過程。目前，關于RET、RBC新參數等方面的研究較少。為了探討抗凝全血樣本放置環境和時間對其穩定性的影響，本研究選取了30例樣本，在2種保存條件下，分別于5個時間點連續檢測，以觀察這些參數的變化規律和穩定性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院臨床樣本30例，患者男15例、女15例，年齡（43±14）歲。30例樣本中，健康體檢者抗凝全血樣本18例（60%）；貧血患者抗凝全血樣本12例（40%），血紅蛋白為89.3（44～138） g/L。

1.2 儀器與試劑

XN-20（日本Sysmex公司）及配套試劑、質控物，乙二胺四乙酸二鉀抗凝真空采血管（美國BD公司）。

1.3 方法

使用乙二胺四乙酸二鉀抗凝真空采血管采集所有研究對象2.0 mL靜脈血，充分混勻，以保證樣本中乙二胺四乙酸二鉀含量為1.5～2.2 mg/mL。測定前確保儀器性能良好，檢測結果穩定可靠，所有樣本均在采集2 h內完成第1次檢測，并以其為基線值。完成第1次測定后，將樣本分別于室溫（20～24 ℃）和冷藏（4～8 ℃）條件下儲存，分別于儲存12、24、48和72 h后進行測定。使用中值和高值質控品每天檢測1次，連續檢測20 d，計算儀器各參數批間精密度[以變異系數（coefficient of variation，CV）表示]。

1.4 評價標準

比較各時間點檢測數據組與2 h基線數據組儀器RET、RBC新參數穩定性評價標準，將結果作為其均值，以差異不超過基線數據標準誤為該參數穩定性可接受，反之則不可接受。

1.5 統計學方法

采用SPSS 15.0軟件計算各參數各時間點數據組均值、標準誤、95%可信區間，采用Excel 2013軟件計算各時間點測定值與基線值的差異。正態分布數據采用±s表示，采用Shapiro-Wilk檢驗對數據進行正態性分析。

2 結果

2.1 批間精密度

收集20 d低、中、高值質控品室內質量控制數據的CV，具體結果見表1。

表1 RET、RBC新參數的批間精密度

2.2 分析穩定性

2.2.1 室溫條件下的穩定性 在室溫條件下，RET%和RET#在樣本采集后能穩定72 h，72 h測定值與基線值的差異分別為0.059 0×1012/L和0.002 3×1012/L，均小于基線組標準誤，即0.217 4×1012/L和0.007 9×1012/L；IRF%、LFR%、HFR%、Hypo-HE%、Hyper-HE%能穩定48 h，48 h測定值與基線的差異分別為-0.94%、0.73%、-0.27%、-0.43%、-0.05%；MFR%和Micro-R%能穩定24 h，24 h測定值與基線值的差異分別為-0.33%和-0.77%；RET-HE只能穩定12 h，而Macro-R%穩定時間不到12 h。見表2。

表2 乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本在室溫條件下RET、RBC新參數穩定性

2.2.2 冷藏條件下的穩定性 在冷藏條件下，除IRF%只能穩定48 h外（48 h測定值與基線值的差異為-0.73%，稍小于室溫條件），其他參數均能穩定72 h以上。見表3。

表3 乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本在冷藏條件下RET、RBC新參數穩定性

3 討論

眾所周知，為保證結果的準確性，實驗室在進行血細胞有形成分檢測時應盡量保證樣本新鮮，但因城市邊際的擴大、各醫療機構的分散、實驗室的中心化、樣本量的劇增等客觀原因，越來越多的樣本無法保證在短時間內完成檢測，這類樣本則不可避免地受到儲存條件的影響。為了解樣本在運輸、儲存過程中發生的變化，樣本穩定性相關研究非常重要。

XN-20利用流體動力聚焦術和鞘流直流電檢測技術，可測定RET和RBC亞群中單個細胞的血紅蛋白含量及體積的特征，生成RET-HE、Micro-R%、Macro-R%、Hypo-HE%和Hyper-HE%等新參數[6]。RET通道中的RBC被核酸染色并采用熒光流式細胞術進行分析，生成前向散射光（forward scatter，FSC）/熒光強度（fluorescence intensity，FSL）散點圖，由于熒光強度與RNA含量成正比，根據熒光強弱把RET從成熟RBC中分離，并根據其在散點圖中的位置，進一步區分HFR、MFR和LFR，而IRF是后兩者之和[7]。RET、IRF等相關參數是反映骨髓造血功能的重要指標；FSC/FSL散點圖中FSC的對數值即為RET-HE，可作為早期鐵缺乏的監測指標[2]。Hypo-HE%和Hyper-HE%由高角度FSC和側向散射光計算得出，分別表示平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）<17 pg和>49 pg的紅細胞所占的百分比；Micro-R%和Macro-R%在RBC/血小板通道進行計數，分別代表MCV<60 fL和>120 fL的RBC所占的百分比；Hypo-HE%反映RBC生命周期中的鐵含量[8]，Hyper-HE%可作為遺傳性球形紅細胞增多癥、自身免疫性溶血的監測指標[9]；在鑒別地中海貧血與缺鐵性貧血時，因Micro-R%在地中海貧血中更高[10]，所以被推薦為鑒別指標。但有學者發現，Micro-R%和Hypo-HE%的比值在上述2種疾病的鑒別方面更加敏感[11]，這些參數均為傳統貧血相關實驗室檢測提供了一種簡單、經濟的補充方案。

本研究結果顯示，XN-20檢測RET%和RET#的結果較為穩定，受儲存溫度和時間影響最小，無論是室溫條件，還是冷藏條件下，均可穩定72 h；而陳梅等[12]認為只可穩定48 h，可能是檢測儀器型號的差異所致。本研究結果表明，IRF%參數在冷藏條件下的72 h穩定性雖有所增強，但仍未到達可接受范圍，即無論室溫放置還是冷藏，均只能穩定48 h；在室溫條件下，LFR%、HFR%、Hypo-HE%、Hyper-HE%只能在48 h內保持穩定，但在冷藏條件下則可穩定72 h，原因可能為IRF%、LFR%和HFR%代表網織紅細胞老化的情況，而網織紅細胞在室溫條件下更易成熟和衰老；MFR%和Micro-R%室溫放置只能穩定48 h，在冷藏條件下則可穩定72 h；Macro-R%室溫放置12 h后即超出可接受范圍，而在冷藏條件下可穩定72 h，原因可能為Hypo-HE%和Hyper-HE%與MCH有關，Micro-R%和Macro-R%則與MCV大小有關，全血樣本在室溫下放置，受樣本中RBC滲透壓的影響，血漿中的水分隨時間的延長緩慢進入紅細胞內部引起細胞腫脹，從而導致MCV的增高和MCH的減低；而低溫可讓RBC無氧酵解代謝速度放緩，從而保證RBC膜鈉鉀離子泵正常功能得以維持，所以血漿中的水分滲入紅細胞內部的速度大大減緩[13]。與室溫放置相比，在冷藏條件中保存，RET-HE穩定性大幅提高，穩定時間從原來的12 h提升至72 h。但有研究結果表明，無論室溫放置，還是冷藏保存，RET-HE在48 h內均非常穩定[14]。本研究發現，延長樣本存儲時間至72 h后，RET-HE冷藏保存比室溫放置要穩定得多（0.44 g/L和-1.23 g/L）。

綜上所述，乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本進行RET和RBC新參數檢測時，仍會受到儲存溫度和時間的影響，實驗室應盡量保證樣本新鮮，如不能及時檢測，需冷藏保存，以保證結果的準確性。