果糖對γ射線照射V79細胞的輻射保護作用

胡 靜，鄭 越

(解放軍總醫院醫療保障中心藥劑科，北京 100853)

電離輻射是一種電磁波或粒子，當它通過物質時，能夠產生離子，并立即引起生物組織的化學變化。一定時間后這些改變可能導致細胞損傷，最終也可能導致細胞或生物體死亡[1]。 這些細胞損傷對可能遭受軍事、太空旅行的電離輻射暴露人群，以及接受放療的癌癥患者和核電行業的工作人員至關重要[2]。 有報道認為，活性氧(ROS)是電離輻射引起的細胞損傷的介質，因此，調節這些物質的化合物在保護細胞免受輻射損傷方面可能具有重要意義。近年，研究人員已經投入了大量精力開發具有抗氧化作用的化學輻射保護劑，這些保護劑可以在進入放射性污染場所之前服用[3-5]。 然而，現有的輻射保護劑的輻射防護作用不夠持久，毒性與其在細胞保護劑量下的使用有關，且在暴露于輻射前使用最有效[2]。雖然適用于部分臨床情況，例如放療患者，但仍然無法應用于各種緊急情況。目前，阿米福汀是被美國食品藥品監督管理局批準的放射性保護藥物[6]，仍需要開發更多的保護劑。果糖是傳統中藥方劑四物湯中的主要活性成分，已被證實能保護小鼠免受γ射線輻射[7]。果糖通過阻止參與氧化還原循環的谷胱甘肽二硫化物外流，有效地防止呋喃妥因誘導的氧化應激而不產生細胞毒性[8]，通過抑制鐵氧化來保護氧化劑誘導的細胞損傷，對氰化物、寡霉素、過氧化叔丁醇、甲萘醌和胱胺的毒性具有良好的防護作用，而果糖也是臨床常用的化學放射保護劑的重要成分之一[9]。所有這些都表明果糖可能是一種潛在的輻射防護劑，本文將初步探討果糖的輻射防護作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

DMEM細胞培養基和新生牛血清(NBS)購自新西蘭Invitrogen公司。胰蛋白酶購自美國Amresco公司。果糖(純度大于99.5%)購自中國藥品生物制品檢定所(北京)。二乙酸二氯熒光素(DCFH-DA)購自瑞士Fluka公司。

1.1.2細胞

實驗使用中國倉鼠肺成纖維細胞(V79細胞)，將細胞培養于25 cm2培養瓶中，加入含10% NBS的DMEM，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，置于5% CO2、溫度37 ℃的培養箱中培養。根據實驗方法分為對照組、輻射組和果糖組，對照組不做特殊處理，輻射組使用輻射處理，果糖組則在輻射組基礎上使用果糖處理。

1.2 方法

1.2.1輻射

輻照前12 h以適當的數量接種細胞，使細胞貼壁，室溫下，以鈷-60源照射，劑量率0.216 Gy/min。輻照后立即更換培養基。

1.2.2克隆形成率實驗

采用V79細胞單層培養法測定果糖的抑制細胞毒性和放射保護作用。選擇每個培養皿細胞的數量，使50～100個菌落在特定處理后能夠存活。 將固定數量的細胞置于含有2 mL培養基的35 mm培養皿中，在添加不同濃度的果糖之前，讓細胞貼壁12～16 h。 用預熱的新鮮培養基(對照培養皿)或含藥物培養基代替原培養基，再過24 h后，輻射培養皿，再用熱的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1次，然后將細胞培養在37 ℃，5% CO2溫育3 d。所得的菌落用無水甲醇固定，吉姆薩染色，只計數超過50個細胞的菌落，細胞存活率用溶媒處理(培養基)對照的百分比表示。

1.2.3實驗細胞的活力測定(MTS)分析

細胞在96孔板上以3×103個細胞/孔的密度生長。培養12 h后，向細胞加入不同濃度(0、10、50、250、500 μg/mL)的果糖，并在37 ℃下將細胞再培養24 h。孵育后，對細胞進行輻射，然后在照射細胞48 h后，加入20 μL MTS溶液，在37 ℃下再孵育4 h。使用VictorTM1420酶標儀(芬蘭Wallac公司)讀取490 nm處吸光度。同理，相同方法測定了用果糖預處理12 h及后處理48 h的細胞暴露于輻射后活力變化。

1.2.4臺盼藍排除法

將細胞培養在25 cm2的培養瓶中，培養12 h后，將不同濃度的果糖加入細胞中，細胞在37 ℃再孵育24 h。培養后，對細胞進行照射。照射48 h后，臺盼藍染色后進行細胞計數。將細胞懸浮液與相當體積的0.4%臺盼藍溶液混合，隨后在光學顯微鏡下進行檢測。細胞活力用存活細胞占細胞總數的百分比來表示。同理，相同方法測定了用果糖預處理12 h及后處理48 h的細胞暴露于輻射后活力變化。

1.2.5超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定

測量CAT活性的方法按照文獻[10-11]描述。將細胞提取物添加到3 mL含10 mmol/L H2O2的50 mmol/L磷酸緩沖液中(pH 7.8)，并立即在240 nm下測量。CAT活性以每克蛋白質單位(U/mg)表示。

1.2.6ROS測定

用二乙酸二氯熒光素(DCFH-DA)檢測ROS。直接向培養基中加入DCFH-DA工作液10 μmol/L，37 ℃孵育15 min。然后用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)去除細胞，用流式細胞儀測量熒光增強的細胞數量。在測定果糖對ROS水平的影響時，細胞在照射前24 h暴露于果糖中，48 h后用DCFH-DA染色。在488 nm和525 nm處讀取吸光度(Ex 485 nm和Em 535 nm)。比較3組2′,7′-二氯熒光素(DCF)水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 V79細胞的輻射敏感性

存活分數與輻射劑量的函數關系表明細胞對γ射線敏感，克隆形成率實驗允許SF2的特性(2 Gy存活分數)為(0.58±0.03)Gy，見圖1。

圖1 不同劑量γ射線照射后V79細胞的存活率

2.2 果糖對細胞存活的保護作用

在果糖存在的情況下，測量2 Gy照射后細胞克隆形成存活率，結果顯示即使在1 250 μg/mL的高濃度下，果糖也沒有表現出細胞毒性。在輻射前用不同濃度的果糖處理細胞24 h，并測定不同果糖處理濃度的存活率，結果顯示果糖的保護作用不同程度地依賴于果糖濃度。在10 μg/mL的低濃度下，與對照組比較，果糖組細胞存活率提高。果糖濃度從50 μg/mL提升至500 μg/mL時，細胞存活率也逐漸提高，在500 μg/mL時達到穩定，見圖2、3。

與輻射組比較，果糖組存活細胞均增多，且這種保護作用與暴露于輻射前后的果糖添加時間無關。MTS法和臺盼藍排除法也證實了果糖對電離輻射的防護作用。用MTS法和臺盼藍排除法測定輻射后48 h細胞存活率，結果表明果糖組V79細胞存活率較對照組提高，見圖4～6。

圖2 不同濃度果糖對V79細胞毒性的影響

a：P<0.05，與輻射組比較。

a：P<0.05，與輻射組比較。

a：P<0.05，與輻射組比較。

a：P<0.05，與輻射組比較。

2.3 果糖對SOD和CAT活性的影響

輻射組在輻射24、48 h的SOD活性均低于對照組，果糖組SOD活性在輻射24 h明顯降低，而在輻射48 h明顯增加。24、48 h后，對照組和果糖組CAT活性有明顯差異，而輻射組和果糖組CAT活性基本一致，見圖7、8。

a：P<0.05，與對照組比較。

2.4 果糖對DCF熒光的影響

與對照組比較，輻射組DCF熒光增強，果糖組DCF熒光強度較輻射組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖9。

a：P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

四物湯是由地黃、當歸、川芎、芍藥組成的傳統經典名方，在我國已有一千多年的應用歷史[12]，其具有造血、增強細胞免疫和放射防護等作用[13]。果糖是四物湯的主要成分，已證實其在部分壞死和凋亡的細胞模型中具有細胞保護作用[14]。然而，果糖是否具備保護細胞免受放射性損傷的能力還不得而知。本文報道了在γ射線照射下果糖對V79細胞具有輻射防護作用，并采用了3種方法檢驗，取得了一致性結果。

對于細胞保護機制，首先考慮通過增加糖酵解活性和產生三磷酸腺苷來介導[15]，筆者認為果糖也可以通過作用于其他部位來提供保護。眾所周知，ROS在輻射損傷過程中損害了細胞關鍵成分，如DNA、蛋白質和脂類，從而導致細胞死亡，并最終導致組織的物理和化學損傷。針對活性氧的保護路徑，已經發現多種抗氧化防御機制。這些抗氧化防御系統包括：(1)金屬螯合物，如銅藍蛋白和轉鐵蛋白，能夠通過抑制Fenton或其他金屬催化反應來防止ROS的形成；(2)低分子量抗氧化劑，如抗壞血酸，谷胱甘肽和生育酚；(3)ROS相互作用的酶，如SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶[16]。因此，本實驗通過測定分析SOD、CAT活性及ROS水平，闡釋了果糖對細胞的保護機制可能是通過刺激抗氧化酶來發揮其有效的抗氧化劑作用。

綜上所述，果糖通過刺激SOD活性和降低ROS水平對V79細胞產生一定的抗輻射保護作用，其確切機制及電離輻射導致細胞死亡的機制尚有待深入研究，以期為開發新的輻射保護劑提供數據支撐。