異丙酚抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

顧竹劼，胡雙雙，師小偉，馬 鈺，陸敏敏，汪建勝△

(1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院麻醉科，上海 201999；2.上海市第七人民醫(yī)院，上海 200137)

心肌纖維化由心肌內(nèi)過多的細(xì)胞外基質(zhì)積累引起，與微血管減少和硬度增加有關(guān)[1]，目前，尚沒有治療的特定藥物[2]。內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化可促進(jìn)心臟纖維化[3]。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞衍生的內(nèi)皮素-1(ET-1)通過內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的刺激促進(jìn)了糖尿病患者心臟纖維化[4]。實(shí)驗(yàn)揭示內(nèi)皮還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶通過內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制促進(jìn)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的間質(zhì)性心肌纖維化和舒張功能障礙[5]。研究認(rèn)為，對調(diào)節(jié)心臟纖維化具有潛在作用的治療靶點(diǎn)，也可能有助于心臟重構(gòu)的治療[6]。成纖維細(xì)胞可能增強(qiáng)了固有的心肌硬度并導(dǎo)致舒張功能障礙[7]。既往研究認(rèn)為，活性氧(ROS)對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和ET-1基因表達(dá)至關(guān)重要，防止過量的ROS產(chǎn)生對預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病具有有益作用[8]。異丙酚是一種抗氧化劑，可防止氧化性細(xì)胞損傷[9]，是通過一氧化氮合酶(eNOS)影響氧化應(yīng)激及調(diào)節(jié)心室重構(gòu)的[10]，蛋白激酶B(Akt)有助于增強(qiáng)eNOS的磷酸化和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生[11]，Akt、NO或兩者同時(shí)充當(dāng)細(xì)胞中存活信號的下游效應(yīng)子。本研究探討了異丙酚對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞生長的抗增殖作用，闡釋異丙酚在心肌纖維化中的可能作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

按照文獻(xiàn)[12]方法，獲得、分離新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞。使用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)中含有1%(w/v)胰蛋白酶、0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.1%膠原酶的酶混合物，將切碎的心室心肌連續(xù)消化10次，每次消化6 min。培養(yǎng)基和補(bǔ)品購自美國Hyclone公司。將產(chǎn)生的分離的細(xì)胞混合物在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)鋪板1 h，以分離成纖維細(xì)胞。去除富含心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基添加到預(yù)鋪板的成纖維細(xì)胞中并培養(yǎng)過夜。使用第2～4代心肌成纖維細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢⑴囵B(yǎng)細(xì)胞分為對照組、誘導(dǎo)組、異丙酚處理組和抑制劑組。對照組為正常培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞；誘導(dǎo)組使用100 nmol/L AngⅡ與細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h；異丙酚處理組在誘導(dǎo)組的基礎(chǔ)上與100 μmol/L異丙酚共同培養(yǎng)；抑制劑組在心肌成纖維細(xì)胞中應(yīng)用100 mg/L的eNOS抑制劑和50 nmol/L的siRNA，以抑制Akt和eNOS的功能。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞增殖檢測

通過在指示的存在或不存在的試劑下定量5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)摻入來評估增殖。細(xì)胞饑餓24 h，將細(xì)胞以有或沒有異丙酚預(yù)處理4 h，用AngⅡ(100 nmol/L)刺激24 h。向每個孔中加入20 mL的MTT(5 mg/mL，美國Sigma公司)，并在37 ℃下再孵育4 h，除去培養(yǎng)基并添加100 mL的二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)。使用ELISA酶標(biāo)儀(美國Invitrogen公司)在490 nm波長下測量吸光度。BrdU摻入測定法也用于檢測細(xì)胞增殖。處理后將CF進(jìn)行胰蛋白酶處理，接種到96孔板中，并在含10 mol/L BrdU的完全培養(yǎng)基中生長24 h。使用ELISA酶標(biāo)儀(美國Invitrogen公司)在450 nm波長下測量BrdU摻入細(xì)胞DNA中的情況。

1.2.2細(xì)胞凋亡評估

將相等數(shù)量的心肌成纖維細(xì)胞鋪在96孔微孔板上(1×104個細(xì)胞/孔)。加入AngⅡ和丙泊酚后孵育24 h，在無菌條件下(終濃度為0.5 mg/mL)將MTT加入每個孔中，并將板在37 ℃溫育4 h。通過抽吸除去未轉(zhuǎn)化的MTT，并將甲crystal晶體溶解在DMSO中(150微升/孔)。使用Bio-Rad自動酶免疫分析儀在540 nm激發(fā)波長處以光度法對甲crystal晶體進(jìn)行定量。

1.2.3NADPH氧化酶活性測定

使用發(fā)光素增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法測定微粒體膜級分中的NADPH氧化酶活性。為了分離微粒體膜，在250 mol/L蔗糖、5 mol/L HEPES(pH 7.4)、1 mol/L苯基甲基磺酰氟、10 g/mL抑肽酶和5 g/mL亮肽素中制備細(xì)胞勻漿，1 000 r/min、4 ℃離心10 min。棄去沉淀，并將上清液在8 000 r/min、4 ℃離心10 min。再通過29 100 r/min、4 ℃離心20 min，從細(xì)胞質(zhì)中分離微粒體級分。使用二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定法(Rockford，美國Pierce公司)測量蛋白質(zhì)濃度，并將其調(diào)節(jié)至2 mg/mL。將總體積為250 mL的細(xì)胞懸浮液與250 mL的含500 mol/L產(chǎn)黃精蛋白的漢克平衡鹽溶液混合，并在37 ℃下保持10 min。通過添加10 μL NADPH(100 mol/L)作為底物來啟動NADPH氧化酶活性測定。測量光子發(fā)射，并減去各自的背景計(jì)數(shù)。單獨(dú)的細(xì)胞級分和單獨(dú)的NADPH都不會引起任何熒光黃質(zhì)化學(xué)發(fā)光信號。

1.2.4ROS水平檢測

通過光澤精蛋白放大的化學(xué)發(fā)光法測量ROS的產(chǎn)生。將治療后的心肌成纖維細(xì)胞立即用含有光澤精蛋白(500 mol/L)的裂解緩沖液裂解。加入裂解緩沖液后立即開始讀數(shù)。使用微板閃爍計(jì)數(shù)器(Topcount，澳大利亞Packard Instrument公司)，將每個讀數(shù)記錄為單光子計(jì)數(shù)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)分析

通過異硫氰酸胍-苯酚氯仿法從細(xì)胞中分離總RNA。使用MaximeRTPreMix試劑盒(韓國iNtRON Biotechnology公司)，從1 mg總RNA合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa公司)和AB 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。每個樣品進(jìn)行4次分析，并將靶基因標(biāo)準(zhǔn)化為參考管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶。從心肌成纖維細(xì)胞中分離總RNA，使用TRIzol試劑(加拿大Invitrogen公司)根據(jù)制造商的方案提取。使用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑(加拿大Applied Biosystems公司)將每個樣品約5 mg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。β-肌動蛋白被用作定量和定性對照以標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)，使用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。用于反應(yīng)的引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6Western blot分析

將心肌成纖維細(xì)胞接種到60 mm組織培養(yǎng)皿中，孵育24 h，進(jìn)行Western blot分析。在放射免疫沉淀測定緩沖液(10 mol/L Tris，pH 7.5、150 mol/L NaCl，5 mol/L 0.1%十二烷基硫酸鈉、1.0% Triton X-100、1%脫氧膽酸鹽)中獲得全細(xì)胞提取物乙二胺四乙酸(EDTA)、1 mol/L原釩酸鈉。封閉后，將膜與一抗在4 ℃孵育過夜。主要抗體為抗a-SMA、抗Ⅰ型膠原蛋白、抗纖連蛋白、抗轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-b1、抗Smad2/3、抗p-Smad2/3和抗GAPDH(美國Santa Cruz Biotechnology公司)。提取物或蛋白質(zhì)通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上并用抗血清探測，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體探測。為了定量顯示W(wǎng)estern blot結(jié)果，通過Gel-Pro Analyzer4.0版軟件對靶蛋白Akt、eNOS進(jìn)行了吸光度分析。根據(jù)制造商的說明(美國Pierce公司)，通過化學(xué)發(fā)光使蛋白質(zhì)可視化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖情況檢測

第24、72小時(shí)，誘導(dǎo)組較對照組細(xì)胞增殖能力升高，異丙酚處理組較誘導(dǎo)組降低(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 72 h心肌成纖維細(xì)胞的增殖情況(免疫細(xì)胞化學(xué)法，×200)

表2 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

2.2 細(xì)胞凋亡與活力測定

與對照組比較，誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞活力升高；與誘導(dǎo)組比較，異丙酚處理組細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞活力降低(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 細(xì)胞凋亡情況(免疫熒光，×200)

表3 細(xì)胞凋亡與活力測定

2.3 NADPH氧化酶和ROS水平檢測

誘導(dǎo)組NADPH、ROS活性較對照組升高，異丙酚處理組較誘導(dǎo)組降低(P<0.05)，見表4。

2.4 RT-qPCR檢測結(jié)果

誘導(dǎo)組ERK、AP-1和ET-1 mRNA相對表達(dá)水平較對照組升高，異丙酚處理組較誘導(dǎo)組降低(P<0.05)，見圖3、表5。

表4 NADPH氧化酶和ROS水平檢測

圖3 RT-qPCR檢測結(jié)果

2.5 Western blot檢測結(jié)果

異丙酚處理組Akt、eNOS相對表達(dá)水平較誘導(dǎo)組降低，抑制劑組較異丙酚處理組升高(P<0.05)，見表6。

表5 RT-qPCR檢測ERK、AP-1和ET-1 mRNA相對表達(dá)水平

表6 Western blot檢測Akt、eNOS相對表達(dá)水平

3 討 論

心力衰竭是各種心臟疾病的終末結(jié)果[13]。病理生理學(xué)研究表明，成纖維細(xì)胞在心臟纖維化的發(fā)展和左心室病變的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性重塑作用，并導(dǎo)致舒張功能障礙[14]。研究顯示，氧化應(yīng)激在左心室重塑中具有比較重要的作用，而抗氧化劑可以在一定程度上改善左心室重塑[15]。異丙酚是臨床較為常用的一種靜脈麻醉藥，常用于全身麻醉的誘導(dǎo)、麻醉維持，對氣管插管機(jī)械通氣的患者具有較為明顯的鎮(zhèn)靜作用。本研究結(jié)果顯示，異丙酚可通過干擾ROS的生成實(shí)現(xiàn)對心肌成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用，在此過程中涉及Akt/eNOS/NO信號通路的激活。

研究表明，胰島素樣生長因子1、AngⅡ和ET-1等因子水平的升高可能導(dǎo)致心肌肥大和心臟纖維化的發(fā)展，從而促進(jìn)了心臟重構(gòu)[16]。新近研究發(fā)現(xiàn)，不同的病理損傷所致的心臟纖維化，其中的纖維狀膠原蛋白的增殖并不成比例，且可刺激分化，導(dǎo)致膠原蛋白沉積、遷移和增殖[17]。在包括心肌成纖維細(xì)胞在內(nèi)的許多類型的細(xì)胞中，NADPH氧化酶可產(chǎn)生ROS，而AngⅡ可能是有效的成纖維細(xì)胞增殖刺激物[18]。異丙酚具有較強(qiáng)的清除氧自由基、抗氧化作用，本研究結(jié)果顯示，異丙酚對心肌成纖維細(xì)胞中的ET-1表達(dá)，ROS和NO生成均具有較為明顯的抑制作用。

研究表明，氧化應(yīng)激會導(dǎo)致器官發(fā)生不同程度的纖維化[19]，氧化應(yīng)激的激活對充血性心力衰竭心肌的收縮功能障礙可能具有一定的作用。NADPH氧化酶通過將NADPH上的電子轉(zhuǎn)移到氧分子產(chǎn)生ROS。研究表明，異丙酚在體內(nèi)和體外均具有一定程度的抗氧化作用，可以改善內(nèi)皮功能障礙，以及抑制缺血再灌注損傷，研究者認(rèn)為這可能與其抗炎能力和抗氧化活性有關(guān)。本研究結(jié)果表明，異丙酚可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞ET-1表達(dá)和細(xì)胞增殖，該研究進(jìn)一步證實(shí)在心肌成纖維細(xì)胞中AngⅡ升高可導(dǎo)致NADPH氧化酶活性和細(xì)胞內(nèi)ROS激活，而異丙酚對上述氧化應(yīng)激具有明顯的抑制效果。

研究表明，NO觸發(fā)的凋亡或保護(hù)細(xì)胞免受凋亡刺激往往取決于NO的濃度[20]。eNOS或神經(jīng)元NOS產(chǎn)生的相對較低的生理濃度的NO可以作為一種有益的保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，Akt的激活可以進(jìn)一步激活eNOS，從而導(dǎo)致NO的產(chǎn)生和細(xì)胞存活率的提高[21]。Akt/eNOS/NO途徑是許多細(xì)胞類型中重要的生存途徑。實(shí)驗(yàn)室研究表明，異丙酚可以刺激培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞中的NO釋放，異丙酚誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生，以及通過其抗氧化作用，進(jìn)而抑制循環(huán)應(yīng)變誘導(dǎo)的ET-1表達(dá)，上述機(jī)制被認(rèn)為可能是異丙酚在內(nèi)皮細(xì)胞中的保護(hù)機(jī)制。本研究結(jié)果證明，異丙酚可調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和ET-1基因在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。經(jīng)過異丙酚治療，明顯增強(qiáng)了心肌成纖維細(xì)胞中eNOS和Akt的磷酸化。有研究表明，異丙酚增加了NO的產(chǎn)生，而Akt/eNOS/NO信號通路可能參與了異丙酚對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響。還有研究認(rèn)為ROS是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的介體，可能涉及多種生理和病理生理事件的誘導(dǎo)和(或)發(fā)展，如心肌細(xì)胞肥大和心肌成纖維細(xì)胞增殖。此外，ROS水平升高可能也參與細(xì)胞增殖，異丙酚可以抑制AngⅡ介導(dǎo)的NADPH氧化酶活性。

綜上所述，異丙酚可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ROS形成、ERK磷酸化及AP-1介導(dǎo)的分子活性和ET-1基因表達(dá)。此外，異丙酚還可以加速Akt和eNOS的磷酸化程度，進(jìn)而增加心肌成纖維細(xì)胞NO的產(chǎn)生。