HPV感染與CIN及宮頸組織PAK1、Spred1表達關系的病理研究

劉 岑，王 芬，馬 蘭，張紅霞

(鄂東醫(yī)療集團黃石市婦幼保健院/湖北理工學院附屬婦幼保健院產科，湖北黃石 435003)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，運用宮頸液基薄層細胞學進行宮頸癌的監(jiān)控預測具有重要的臨床意義[1]。人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染可影響宮頸組織多種信號通路的傳導[2]，是宮頸上皮內瘤變(CIN)的高危因素，CIN及宮頸癌均和感染高危型HPV具有密切相關性[3]。CIN不同病變的宮頸組織中P21活化激酶(PAK1)和Spred1的表達PAK1/Spred/MAPK信號通路在CIN發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。PAK1參與在細胞增殖、細胞轉化、細胞骨架系統(tǒng)重排、細胞凋亡過程[4]，Ras-MAPK途徑在細胞的生長、分裂、增殖和分化過程中起重要協同作用，Spred可抑制細胞分化，對多種生長因子誘導的Ras-ERK途徑均有抑制作用。P21活化激酶在正常宮頸組織一般情況不表達，宮頸前驅病變均為高危型HPV感染所致，隨著CIN級別增高，血清PAK1蛋白陽性表達表達量亦隨之升高，趙健等[5]研究證實慢性宮頸炎P21蛋白表達陽性率及高危型HPV病毒呈正相關。 P21活化激酶受內分泌激素的調節(jié)成為與宮頸組織相關的特殊分化組織P16、18，作為細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑，HPV癌基因E6、E7的持續(xù)表達造成CIN中P16的過度表達，使P16的負反饋抑制解除，致使P16表達異常，是高危型HPV感染并引致宿主細胞變異的客觀表現，在宮頸病變的早期診斷中發(fā)揮作用[6]。對HPV感染的流行病學和分子生物學研究，有助于宮頸癌的早期診斷和聯合治療，使患者預后得到明顯改善[7]。本文對CIN中PAK1、Spred1的表達水平及病理特征進行分析，并就CIN與高危型HPV感染的相關性進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1-12月臨床檢驗中心手術后送檢的200例宮頸組織標本，獲得CIN組織標本76份。CIN采用2009年國際婦產科聯合會(FIGO)臨床分期標準進行分期，CIN標本中CINⅠ期31例、Ⅱ期27例、Ⅲ期18例；低分化29例，中分化28例，高分化19例；有淋巴結轉移27例，無淋巴結轉移49例。選取同期因其他疾病行全子宮切除的58例患者的正常宮頸組織作為對照，患者年齡37～68歲，平均(51.50±6.20)歲。所有患者術前3個月均未接受藥物治療、放療、新輔助化療或中藥治療，且臨床病理資料完整、病例信息完整。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查備案，征得患者或配偶知情同意，保護其隱私和匿名權，所有資料僅用于研究。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學法

兔抗人PAK1多克隆抗體bs-17685R、DAB顯色試劑(北京中山試劑公司提供)1∶50倍稀釋、兔抗人Spred1多克隆抗體1∶75倍稀釋；采用免疫組織化學法檢測，按照要求步驟進行操作。PAK1及Spred1采用雙盲法按著色強度和陽性細胞數進行分級，低倍鏡視野計數取各視野中陽性數的平均值作為陽性細胞數量，以兩者相乘的結果作為最終評分，≤3分為陰性，>3分為陽性[8]。

1.2.2宮頸組織病變病理檢查

取宮頸組織標本于固定液內固定12 h以上，脫水2 h進行透明處理，浸蠟3 h石蠟包埋切片(厚度3 μm)，脫蠟10 min后水化，采用蘇木素-伊紅(HE)染色封片，標本低倍鏡觀察不同宮頸組織病變各期CIN病理特征和高危型HPV感染與宮頸組織病變病理。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS23.0軟件進行數據分析，計數資料以頻數或百分率表示，比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，相關性采用Spearman分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同病理組織PAK1和Spred1蛋白陽性表達比較

正常宮頸組織、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ期PAK1蛋白陽性表達率逐漸升高，Spred1蛋白陽性表達率逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同病理組織PAK1和Spred1蛋白陽性表達率比較[n(%)]

2.2 高危型HPV感染后不同宮頸組織病變病理特征

CIN宮頸組織標本見圖1～3。少量宮頸及外陰組織活檢病理結果為外陰鱗狀上皮內瘤變Ⅲ期伴HPV感染(HPV16/18+、HPV31/33-)，CINⅡ期伴HPV16和HPV18感染，見圖4。

圖1 宮頸組織CINⅠ期病理圖片(HE,×100)

圖2 宮頸組織CINⅡ期病理圖片(HE,×100)

圖3 宮頸組織CINⅢ期病理圖片(HE,×100)

2.3 不同病理特征PAK1和Spred1陽性表達比較

PAK1陽性表達與病理分級和淋巴轉移有關，而Spred1陽性表達與病理分級有關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

圖4 宮頸組織CINⅡ期伴HPV16、18感染病理圖片(HE,×100)

表2 不同病理特征PAK1和Spred1陽性表達比較[n(%)]

2.4 高危型HPV感染與PAK1、Spred1表達的相關性

高危型HPV感染與PAK1、Spred1均有相關性(P<0.05)，且PAK1與Spred1表達呈負相關(r=-0.504，P<0.001)，見表3。

3 討 論

CIN已經成為造成女性腫瘤患者死亡的重要原因，該病多以遺傳、慢性婦科炎癥等因素而引起[9]，而高危型HPV已成為CIN的重要致病因素。秦麗等[10]meta分析結果證實，陰道菌群以非乳酸桿菌為優(yōu)勢的女性更可能與HPV感染，發(fā)生宮頸病變或宮頸癌相關。近年來隨著分子靶向藥物的臨床應用治療多種腫瘤，取得了比較理想的治療效果，因此，對靶向治療敏感的分子信號通路的研究，是腫瘤治療領域內的熱點問題[11]。 PAK1是蘇氨酸蛋白、絲氨酸蛋白激酶，作為Rho下游的靶蛋白和MAPK上游的調節(jié)蛋白[12],PAK1主要通過結合CDC42或Rac1被激活, 調節(jié)平滑肌細胞活力和形態(tài)，在瘤體的生成及轉移過程與腫瘤血管中起相互作用，腫瘤細胞生長所需營養(yǎng)物質通過腫瘤血管供給瘤體生長，有報道PAK1的表達與人鱗狀細胞癌的分期和分級相關[13]。劉暢等[14]研究發(fā)現P21活化激酶能夠抑制MAPK信號通路的活化，因此，PAK1與CIN的發(fā)病、發(fā)展存在潛在關系。

PAK1過度表達是CIN過程中的一個早期事件，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移及演進過程有密切的關系[15]。Spred1在RhoA介導的細胞運行及信號的轉導中起作用，Notch 基因的細胞表面受體影響細胞形態(tài)發(fā)生、發(fā)展的多個過程，影響母細胞的分化、細胞增殖及細胞凋亡過程，Notch1的作用在不同細胞中運行機制不同，基因位點突變引起的表型改變，表明Notch信號作用的多樣性，在機體細胞組織腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，通過與活化的RhoA結合來抑制其誘導的Rho激酶的激活，抑制腫瘤細胞的凋亡誘導細胞增殖，調節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)廣泛分布于多種惡性腫瘤間質中，它的聚集程度與腫瘤的不良預后密切相關，可以認為CINⅠ期可向正常組織轉化。在Spred1、PAK1、MAPK信號通路中，Spred1為抑癌基因，PAK1為促癌基因，通過上調Spred1為靶向蛋白，達到抑制PAK1的活化[16]，提示PAK1與Spred1的相互作用在高危型HPV持續(xù)感染情況下，HPV通過感染、整合、癌變3個階段，導致宮頸癌前病變的發(fā)生、發(fā)展，引起陰道上皮細胞成熟障礙，形成陰道上皮細胞的不典型增生。Spred1可能具有一種抑癌基因的潛能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抑制作用，當Spred1基因突變使抑制功能下調，對PAK的負調控作用引起PAK1表達水平的上調，下游蛋白MAPK作用上調導致CIN的發(fā)生、發(fā)展。

腫瘤轉移是惡性腫瘤的重要生物學特征，有約10%的患者術后較快出現復發(fā)和淋巴結轉移，可能與癌細胞微轉移有關[17]，Spred1基因誘導腫瘤靶細胞的破壞，來降低惡性腫瘤的發(fā)生率，宮頸癌患者血清中檢測其水平表達，可以評估宮頸組織皮肌上皮細胞癌變的發(fā)生、發(fā)展，HPV-16持續(xù)感染是影響患者復發(fā)的獨立危險因素[18]。Spred1基因是人類腫瘤中廣泛存在的腫瘤抑制基因，PAK1表達異常是HPV感染并引致宿主細胞變異的客觀表現，在宮頸病變的早期診斷中發(fā)揮重要作用[19]。本研究結果顯示，76例宮頸組織中PAK1陽性54例，陰性22例；Spred1陽性53例，陰性23例，經Spearman相關性分析：PAK1和Spred1表達呈負相關(r=-0.504，P<0.001)。病理檢測結果PAK1和Spred1的表達與高危型HPV感染的相關性(P<0.05)，PAK1蛋白和Spred因子在宮頸組織中的表達與腫瘤的臨床分期及組織學分級相關，陽性表達率比較組織學分級越高，PAK1蛋白的陽性表達率越高，而Spred1因子陽性表達率則越低。Spred1因子水平陽性表達率隨著CIN程度的加重反而降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

本研究顯示，CIN宮頸組織PAK1與Spred1因子表達呈負相關，提示高危型HPV感染與PAK1、Spred1密切相關，過表達可能影響抑癌基因的正常表達，進而影響癌細胞的增殖、遷移，增加其浸潤、轉移風險[20]。臨床CINⅠ期病例很常見，對于該類病例可不采用任何治療僅觀察隨訪。細胞學為高密度鱗狀上皮內病變組織學診斷CINⅡ期時不僅要觀察隨訪，應行LEEP術及時治療，可以阻止宮頸浸潤癌的發(fā)生。對術后病理為CINⅢ期的患者需要定期隨訪，以排除CIN持續(xù)高危型HPV造成CIN的持續(xù)狀態(tài)或復發(fā)和低級別鱗狀上皮內病變的存在，確診后可以選擇宮頸錐切術及外陰單純切除術[21]。對患者進行嚴密觀察宮頸細胞學轉化，有利于監(jiān)測宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后，對于臨床下一步制訂治療方案具有重要的意義。

綜上所述，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟的過程，往往是在多種致病因素作用同時，通過基因相互協調的結果。對高危型HPV感染與PAK1、Spred1在CIN宮頸組織表達的相關性進行研究，可為宮頸鱗癌的早期診斷與治療提供理論依據，對評估CIN近期預后提供參考，具有重要的臨床意義。