1株解淀粉芽孢桿菌的分離、鑒定及在馬鈴薯瘡痂病防治上的應用

糜芳 吳紫燕 王承芳 張瑩瑩 干華磊 毛偉力

摘要：運用形態學、生理生化特征及16S rDNA序列構建系統發育樹等方法，就從上海市浦東新區黃瓜地土壤中分離獲得的1株對馬鈴薯瘡痂病原（Streptomyces scabiei）及多種植物病原菌生長有抑制作用的芽孢桿菌（菌株Ba0002）進行鑒定。結果表明，Ba0002菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。通過液體發酵和劑型處理，將Ba0002菌株制成懸浮劑 （Ba0002-SC），用于對馬鈴薯瘡痂病的大棚盆栽和大田防治試驗，結果表明，對馬鈴薯瘡痂病的防治效果與所施用的Ba0002-SC濃度正相關。當Ba0002-SC的施用濃度為100倍液時，在大棚和大田的防治效果分別達到59.72% 、66.44%，顯著高于化學農藥多菌靈（稀釋500倍）和空白對照處理。大田試驗的測產結果表明，經Ba0002-SC 處理的植株，馬鈴薯產量為2 923.38 kg/667 m2，顯著高于經多菌靈處理的產量（2 776.42 kg/667 m2）。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;分離鑒定;生物防治;馬鈴薯瘡痂病

中圖分類號：S435.32 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）18-0122-06

收稿日期：2020-12-30

基金項目：上海市科委科技支撐項目（編號：16391902400）;大理州毛偉力專家工作站（編號：大科聯發[2019]6號 ）。

作者簡介：糜 芳（1991—），女，四川達州人，助理農藝師，主要從事農業微生物開發與利用研究。E-mail：mif@sh-wlh.com。

通信作者：毛偉力，博士，主要從事植物病理學研究。E-mail：maowl@sh-wlh.com。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）屬茄科，一年生草本植物，塊莖可食用，是全球第4重要的糧食作物[1]。早在2016年，我國就啟動了將馬鈴薯作為主糧的戰略[2]，并在隨后的幾年里，馬鈴薯種植面積和產量呈逐步上升的趨勢。在大規模種植馬鈴薯的同時，也面臨著許多病蟲害的困擾。晚疫病、環腐病、瘡痂病等都是影響馬鈴薯產量的主要病害[3-4]。其中，由鏈霉菌屬（Streptomyces spp.）引起的馬鈴薯瘡痂病是一種土傳和種傳病害[5]，主要危害馬鈴薯的塊莖。侵染初期會在塊莖表面出現褐色小點，逐漸形成各種凸起、凹陷以及扁平狀的近圓形或不定型病斑。瘡痂病可給馬鈴薯生產造成每年數以億計的經濟損失[6]。目前防治該病害的主要方法是輪作以及使用廣譜的土壤殺菌劑或硫酸銅、克菌丹、冠菌銅、代森錳鋅等化學藥劑[7]。但長期使用化學農藥易使病原菌產生耐藥性，并且給生態環境帶來嚴重的污染[8]。因此篩選并開發出對馬鈴薯瘡痂病有較好防治效果的生物制劑，是當前生物農藥研究的重要課題之一。

為保護環境，提高人類健康水平，生物農藥在植物病蟲害防治方面已展現出能減少或取代部分化學農藥的重要作用[9]。在生防細菌中，應用最普遍的有鏈霉菌 （Streptomyces spp.） 、假單胞桿菌（Pseudomonas spp.） 以及芽孢桿菌（Bacillus spp.）[10]等。芽孢桿菌具有抗逆性強，能產生大量抗菌活性物質，產量高、貨架期長等良好特性，其產品已被廣泛應用于植物病害的生物防治[11-12]。解淀粉芽孢桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens） 能夠產生多種抑制植物病原菌的酶類活性物質，包括蛋白酶、纖維素酶等，并且通過產生吲哚乙酸（IAA）、鐵載體、堿性磷酸酶等活性物質來促進植物生長[13]，能有效防治辣椒、西瓜、花生、黃瓜等作物的根腐病、枯萎病、白絹病等[14-16]。高同國等篩選了1株對馬鈴薯瘡痂病病原菌具有較強拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌12-82，其抑菌圈直徑達26.2 mm[17]。說明解淀粉芽孢桿菌在馬鈴薯瘡痂病的防治方面具有潛在的應用前景。

本研究通過梯度稀釋法從黃瓜地土壤樣品中，分離出一株具有廣譜拮抗活性的菌株Ba0002。結合生理生化反應和系統發育分析，確定了Ba0002為解淀粉芽孢桿菌，再通過盆栽和大田試驗，測試其對馬鈴薯瘡痂病的防治效果，旨在為該菌株防治馬鈴薯瘡痂病提供可參考的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 試驗菌株主要有立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）、鏈格孢（Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、稻瘟病原菌（Pyricutaria oryzae）、桑細菌性疫病菌（Pseudomonas syringae pv. mori）、馬鈴薯瘡痂病（Streptomyces scabiei）、解淀粉芽孢桿菌Ba0002等菌株，均由上海萬力華生物科技有限公司分離與保藏。

1.1.2 培養基 試驗培養基主要有馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，用紗布過濾掉土豆渣，濾液中加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂，溶解后補足水至1 000 mL。于1×105 Pa 滅菌20 min。冷卻后倒平板[18]。營養瓊脂（NA）培養基：10 g蛋白胨、3 g牛肉粉、5 g NaCl、20 g 瓊脂，pH值為7.0～7.2。Ba0002發酵培養基：28 g玉米淀粉、2.5 g酵母粉、0.5 g MgSO4、2 g K2HPO4、1 L去離子水。高氏一號培養基：20 g可溶性淀粉、1 g KNO3、0.5 g K2HPO4、0.5 g MgSO4· 7H2O、0.5 g NaCl、0.01 g FeSO4· 7H2O、20 g瓊脂、1 000 mL去離子水，pH值為7.4～7.6。

1.1.3 所用儀器 試驗儀器主要有高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠，LDZX-50KBS）、恒溫培養箱（上海一恒科技儀器有限公司，MCG450BP）、超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，SW-CJ-1CU）、恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司，HWS26）、恒溫搖床（SUKUN SKY-2112B）、PCR儀（杭州柏桓科技有限公司，GT9612）、凝膠成像系統（Gnosens 1550）、分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司，JA2003）、高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，H1650）、渦旋振蕩器（VISION，KMC-1300V）、生物顯微鏡（奧林巴斯，CX21型）等。

1.1.4 所用試劑 試驗主要試劑有PCR mix、細菌基因組DNA抽提試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;Ba0002懸浮劑（Ba0002-SC），由上海萬力華生物科技有限公司研制，有效活菌數為2×109個/mL;多菌靈為遼寧營口雷克農藥有限公司生產的可濕性粉劑;其他化學試劑為國產分析純，購自上海潤捷化學試劑有限公司。

1.1.5 馬鈴薯品種 馬鈴薯品種為室內盆栽試驗：中薯3號。大田試驗：麥肯7號。

1.2 試驗方法

1.2.1 Ba0002菌株的分離與純化 土樣采集：從上海市浦東新區孫橋黃瓜地的土壤耕作層15 cm處取樣200～500 g，采集59份土壤樣本。將土壤在空氣中干燥7 d后進行菌株分離[18]：先將土壤樣本放在滅菌的研缽中，用研磨棒研磨至土壤顆粒均一，放置在80? ℃烘箱烘30 min后，稱取1 g土樣放入含9 mL無菌水的試管中，在渦旋振蕩器上充分振蕩，并取1 mL加入到另一個含9 mL無菌水的試管中，在渦旋振蕩器上混勻后形成10-2的土壤稀釋液，以此類推至10-3、10-4、10-5。吸取10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀釋液100 μL，分別加入到NA培養基上，用涂布棒將稀釋液均勻涂布。將平板放置在37 ℃恒溫培養箱中恒溫培養24 h至培養皿中長出單菌落。采用劃線分離法進行純化并轉入37? ℃恒溫中培養，再將純化培養后的單菌落轉接至NA培養基的試管斜面上，37? ℃培養24 h。

1.2.2 Ba0002菌株對植物病原的拮抗效果 對多個真菌病原的拮抗測試采用平板對峙法[19]，測定解淀粉芽孢桿菌對這些病原菌的拮抗效果。在直徑90 mm的培養皿中加入20 mL PDA培養基。用活化了5 d的病原菌平板，取直徑為5 mm的菌塊置于PDA平皿中央，在距離病原菌塊20 mm處滴加5 μL Ba0002菌液。以只接病原菌塊的處理為對照（CK），每組3個重復。將平板放置在28? ℃的培養箱中培養7 d，測量病原菌的菌落直徑并計算抑菌率。抑菌率=（CK連心線上菌落直徑-處理連心線上菌落直徑）/（CK連心線上菌落直徑-菌塊直徑）×100%。

對細菌病原的拮抗采用平板抑菌法[20]，測定解淀粉芽孢桿菌對細菌病原的拮抗效果。將細菌病原菌液與45? ℃左右的NA培養基混合均勻，加入 20 mL 至90 mm培養皿中，待培養基凝固后，在距離平板中央20 mm處做對稱標記，并在標記處滴入5 μL Ba0002菌液，置于30? ℃培養箱中培養7 d。測量抑菌圈的直徑。抑菌效果=抑菌圈直徑/菌落直徑，比值大于1.5時說明抑菌效果較好。

1.2.3 Ba0002菌株的鑒定 通過形態學、生理生化特征[21]及分子生物學鑒定方法對篩選的Ba0002菌株進行種屬鑒定。

菌落形態觀察：將菌種Ba0002接種在NA培養基上，于37? ℃恒溫培養箱中培養48 h，觀察菌落特征。

生理生化特征鑒定：菌株Ba0002的氧化酶、接觸酶等生理生化項目測定參照《常見細菌系統鑒定手冊》[21] 《伯杰細菌鑒定手冊》的方法。

分子生物學鑒定[22]：利用生工生物工程（上海）股份有限公司的細菌基因組DNA抽提試劑盒提取Ba0002菌株的基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用16S rDNA通用引物（27F、1492R）及gyrB基因引物（g-F、g-R）擴增Ba0002的基因組。引物序列為：27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）、g-F（5′-ATCATGACCGTTCTCCACGC-3′）、g-R（5′-CGTTATGCCGTCTTTCTCGC-3′），PCR反應體系為：PCR mix 10 μL，上游引物：27F 1 μL，下游引物：1492R 1μL，1 μL DNA模板，雙蒸水12? μL。PCR擴增條件為：95? ℃ 5 min;95? ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環;72 ℃ 10 min 。PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果于NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST比對分析，用 MEGA 6.0軟件的 Neighbor-Joining 法構建系統發育樹。

1.2.4 大棚盆栽試驗 于2018年12月至2019年5月，在上海市浦東新區孫橋鎮卉綠農場開展大棚盆栽試驗。將馬鈴薯切塊，將每塊留有1～2個芽眼薯塊栽種到盛有500 g基質的花盆（25 cm×30 cm）中，置于25～28? ℃ 的大棚中生長15 d后，挑取長勢一致的幼苗用于下一步試驗。采用灌根法[17]將瘡痂病原2×108個/mL澆灌接種至馬鈴薯苗的根圍，每株250 mL，以清水澆灌250 mL作為空白對照。間隔10 d后，將稀釋至100倍、200倍、400倍的Ba0002-SC（2×109 CFU/mL）以及多菌靈（500倍稀釋液，化藥對照），采用同樣的灌根法，每株澆灌250 mL，每個處理重復6次。120 d后馬鈴薯收獲時，調查塊莖的發病情況，按下列分級標準記錄，并計算發病率、病情指數和防效。0級：薯皮健康，無病斑;1級：薯皮基本健康，有零星病斑;3級：病斑所占面積為薯皮表面積1/3以下;5級：病斑所占面積為薯皮表面積的1/3～1/2;7級：病斑面積超過薯皮表面積的1/2;9級：薯皮全部被病斑覆蓋。發病率=發病馬鈴薯塊莖數/收獲總馬鈴薯塊莖數×100%。病情指數=∑（各病級塊莖數×該病級代表值）/（調查個體總和×最高病級數）×100。相對防效=（對照組病情指數-處理組病情指數）×100%/對照組病情指數。

1.2.5 大田試驗 2020年在內蒙古自治區呼倫貝爾市海拉爾區海拉爾農業發展園區，開展大田試驗。試驗用藥劑為多菌靈、Ba0002-SC（2×109 CFU/mL），清水為空白對照。采用完全隨機區組設計，每個試驗小區面積為266 m2，行距為 90 cm，株距為20 cm，各試驗小區重復3次，各小區隨機排列。4月20日播種，將馬鈴薯切塊，每塊留有1～2個芽眼，用播種機進行播種。多菌靈和Ba0002-SC分別按照500倍稀釋和100倍稀釋濃度進行稀釋，在播種時對播種的廂溝土壤進行澆灌，開花期采用同樣的稀釋濃度，對馬鈴薯植株根圍再進行一次澆灌。8月28日采收、測產并調查塊莖的發病情況，按“1.2.4”節中的分級標準記錄，計算發病率、病情指數和防效。測產按照各個試驗小區每個重復取3個采樣點，每個取樣點挖出1壟土豆，長度為2 m，稱取所有土豆的質量。薯塊平均畝產=商品薯平均畝產+非商品薯畝產。商品薯平均畝產=∑（單點商品薯質量）/∑（單點面積）×667×（1-雜質率）。非商品薯平均畝產=∑（單點非商品薯質量）/∑（單點面積）×667×（1-雜質率）。其中1 hm2=15畝。非商品薯指質量小于 50 g 的小薯以及病薯、爛薯和綠皮薯等薯塊。雜質率：一般情況下，扣除收獲薯塊總質量的1.5%作為雜質、含土量。

1.3 數據分析

試驗數據采用 Microsoft Office Excel 2019整理，采用SPSS 22分析試驗數據，用Duncans新復極差法進行數據差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

按“1.2.1”節中所述的方法，從59份土樣中共分離得到81株細菌。再按“1.2.2”節的方法，將分離得到的菌株分別與馬鈴薯瘡痂病原原菌進行平板對峙拮抗測試，81株細菌中有13株有抑菌活性，其中有1株細菌的抑菌效果顯著（表1），將其編號為Ba0002。

2.2 Ba0002菌株對植物病原的拮抗效果

2.2.1 Ba0002菌株對真菌病原的抑菌譜 為確定Ba0002菌株的抑菌活性，采用平皿對峙法測定Ba0002菌株對以下病原真菌（R. solani、P. nicotianae、 A. alternata、F. oxysporum、B. dothidea、B. cinerea、P. oryzae）的拮抗效果。結果（表1）表明，除了對F. oxysporum的抑菌率為42.86%，對其他病原菌的抑菌率均大于等于50%，其中對B. cinerea A. alternata、P. nicotianae、P. oryzae等病原菌的抑菌率≥75%。說明Ba0002菌株對大多數病原真菌有抑菌作用。

2.2.2 Ba0002菌株對細菌病原的抑菌效果 在活體抑菌試驗中，Ba0002菌株對馬鈴薯瘡痂病病原（S. scabiei）的抑菌直徑達到22 mm（圖1）。

2.3 菌株Ba0002的鑒定

2.3.1 Ba0002菌株的形態特征 由圖1可知，Ba0002菌株菌落呈圓形，乳白色，邊緣不整齊，扁平，中間有褶皺，不透明;在光學顯微鏡下觀察，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，寬度為0.6～0.8 μm，長度為2.0～4.5 μm;革蘭氏染色為陽性菌。

2.3.2 Ba0002菌株生理生化特征 Ba0002菌株能夠利用葡萄糖、甘露醇、山梨醇、水蘇糖、蔗糖、龍膽二糖作為唯一碳營養，能夠產生β-半乳糖苷酶、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、氧化酶、接觸酶。明膠水解陽性反應，VP反應呈陽性，在pH值為5.0和8%NaCl的NA培養基上都能生長（表2）。

2.3.3 Ba0002菌株16S rDNA序列的分子系統學分析 通過Ba0002菌株的16s rDNA 序列在NCBI BLAST比對，可以看出Ba0002菌株與解淀粉芽孢桿菌（GeneBank登錄號MN585518.1）的相似性高達99.93%。Ba0002菌株的gyrB基因序列系統發育（圖2）分析顯示，Ba0002菌株與B. amyloliquefaciens處于同一個進化分支，同源性高達100%，說明Ba0002菌株與B. amyloliquefaciens親緣關系較近。綜合系統發育樹（圖2）及生理生化反應（表2）分析，鑒定Ba0002菌株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

2.4 大棚盆栽試驗結果

使用Ba0002-SC防治馬鈴薯瘡痂病的大棚盆栽試驗結果見表3、圖3。由表3可知，隨著Ba0002-SC稀釋濃度的增加，Ba0002-SC對馬鈴薯瘡痂病的防治效果也逐漸降低。經Ba0002-SC 100倍稀釋處理的植株，對馬鈴薯瘡痂病的防治效果顯著高于（P<0.05）經200倍、400倍稀釋液以及多菌靈（500倍）的處理;而經多菌靈500倍液以及Ba0002-SC 200倍液、400倍液處理的植株之間，防治效果無顯著性差異，但均顯著高于（P<0.05）病原菌處理。

2.5 大田試驗結果

由表4可知，經Ba0002-SC 100倍稀釋液處理的植株，對馬鈴薯瘡痂病的防效（62.44%）顯著高于經多菌靈稀釋500倍（12.59%）以及空白對照處理。由表5可知， 經Ba0002-SC稀釋100倍植株所收獲塊莖的平均質量（5 846 g）顯著高于經多菌靈稀釋500倍和空白處理植株所收獲的塊莖平均質量（5 552、5 512 g）。

3 結論與討論

芽孢桿菌作為一種重要的生防菌，已廣泛應用于對馬鈴薯瘡痂病和其他植物病害的生物防治中。Li等利用高地芽孢桿菌（B. altitudinis）菌株AMCC 101304在大田測試防治馬鈴薯瘡痂病，春、秋2季防效分別達到76.34% 、65.81%[23]。Cui等從馬鈴薯中分離出了內生貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）菌株8-4，對馬鈴薯瘡痂病防治效果達到了 （51.83±8.53）%，同時該處理馬鈴薯的產量比其他處理高出（19.91±3.56）%[24]。Lin等在盆栽試驗中發現，使用解淀粉芽孢桿菌Ba01可使馬鈴薯瘡痂病的發病率降低（51.4±11.1）%[25]。 本研究使用解淀粉芽孢桿菌 Ba0002-SC 對馬鈴薯瘡痂病的防治效果達到了62.44%，其總產量較空白處理增加了6.06%。與Lin等報道的解淀粉芽孢桿菌具有防病、增產的效果[25]相符。

在農業生產中運用解淀粉芽孢桿菌，不但具有防病的作用，同時還有促進作物生長的功效。解淀粉芽孢桿菌在根際土壤中能分泌大量次級代謝產物。Yan等從解淀粉芽孢桿菌的發酵液中分離得到對植物病原有滅殺作用的脂肽類抗生素iturin A，iturin A可以使病原真菌的膜通透性增加，從而抑制病原菌的生長和孢子萌發[26]。Arrebola等通過色譜分析發現，解淀粉芽孢桿菌的抑菌物質成分主要為伊枯草菌素A[27]。本研究的拮抗測試結果表明，Ba0002菌株不僅對馬鈴薯瘡痂病有較好的防治效果，同時對R. solani、P. nicotianae、A. alternata、B. dothidea、B. cinerea、P. oryzae等多種病原菌有較強的拮抗作用，說明Ba0002菌株在生長過程中能產生類似的抑菌活性物質。在后續的研究中，將進一步探討Ba0002菌株對馬鈴薯瘡痂病的防治機制和Ba0002菌株在生長過程中所產生的有拮抗作用的抑菌活性物質，并拓寬其在其他植物病害上的防治功效。

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