CARD9 PKM2 CMTM6在乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究

李 玲,何 霞,周自城,高曉玉

(四川省雅安市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 雅安 625000)

乳腺癌是最常見(jiàn)且嚴(yán)重威脅廣大女性身心健康的惡性腫瘤，其中浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是危及患者生命安全的主要因素[1]。目前臨床上對(duì)于乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未得到統(tǒng)一言論，認(rèn)為其可能與飲食、環(huán)境、月經(jīng)情況、婚育情況、乳腺疾病病史等因素相關(guān)[2]。目前臨床暫無(wú)治療乳腺癌特效藥，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)乳腺癌在分子水平上具有高度異質(zhì)性，故從分子角度闡明乳腺癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的機(jī)制，尋找乳腺癌新的分子靶標(biāo)[3]。故在本文研究中，選取2019年11月至2020年11月期間于我院就診的79例乳腺癌患者作為研究對(duì)象，檢測(cè)乳腺癌及癌旁組織中胱天蛋白酶募集域蛋白9(Caspase recruitment domain protein 9，CARD9)、M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase，PKM2)、趨化因子樣因子超家族成員6(Chemokine like factor superfamily member 6，CMTM6)表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性，旨在為乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2019年11月至2020年11月我院接診的79例乳腺癌患者研究對(duì)象，年齡35～74歲，平均年齡(51.78±21.11)歲，BMI 24～36kg/m2，平均BMI(28.50±7.13)kg/m2。所有研究對(duì)象及家屬均知情同意本次研究，且經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范(2019年版)》[4]中乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)病理檢查確診為乳腺癌且在我院就診并行手術(shù)且術(shù)后病檢確診為乳腺癌者；③均為首發(fā)病例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年老體弱、存在嚴(yán)重合并癥不適合手術(shù)者；②處于妊娠期或哺乳期的女性；③出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；④近1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過(guò)重大手術(shù)者。

1.2方 法

1.2.1標(biāo)本采集:取乳腺癌患者手術(shù)切除癌組織及癌旁組織標(biāo)本作研究，其中癌組織79例，另外距癌組織>5cm且經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的38例癌旁正常乳腺癌組織作為癌旁組織，將制作的組織標(biāo)本采用40g/L多聚甲醛進(jìn)行固定，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3μm，連續(xù)切片作免疫組化標(biāo)記。

1.2.2免疫組化法檢測(cè)方法:采用免疫組化法檢測(cè)CARD9、PKM2、CMTM6表達(dá)，將癌組織、癌旁組織切片放置在二甲苯中浸泡2次(15min/次)，撈出后將多余水份取出后分別放置在無(wú)水乙醇溶液、95%乙醇溶液以及85%乙醇溶液中浸泡3min，采用自來(lái)水、PBS緩沖液沖洗3次(時(shí)間分別為1min/次、3min/次)；將EDTA抗原修復(fù)液加熱至沸騰后使其處于保溫狀態(tài)并將切片放入已沸騰的修復(fù)液中并繼續(xù)加熱20min，待EDTA溶液冷卻至室溫，將切片取出采用蒸餾水、PBS緩沖液均沖洗3次(3min/次)；去除PBS緩沖液，分別加入100μL的鼠抗人CARD9、PKM2、CMTM6抗體，室溫下孵育60min后，采用PBS緩沖液沖洗3次(3min/次)；去除PBS緩沖液，加入100μL酶標(biāo)羊抗兔IgG聚合物，室溫下孵育15min后采用PBS緩沖液沖洗3次(3min/次)；去除PBS緩沖液，加入100～200μL DAB顯色液孵育3～5min，顯微鏡下觀察染色結(jié)果；自來(lái)水沖洗切片后采用蘇木素染色液復(fù)染10～30s，采用PBS緩沖液沖洗反藍(lán)；脫水、透明、封片：并將切片分別放置在無(wú)水乙醇溶液、95%乙醇溶液以及85%乙醇溶液中浸泡3min，二甲苯透明，然后采用中性樹(shù)膠和蓋玻片封片，顯微鏡鏡查。免疫組化染色結(jié)果:于高倍鏡(×200)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，①染色強(qiáng)度：無(wú)著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分；②陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：陽(yáng)性細(xì)胞<10%、陽(yáng)性細(xì)胞1%～50%、51%～75%、>75%分別記為0分、1分、2分、3分，上述兩者乘積作為最后結(jié)果，陰性、陽(yáng)性分別為0～1分、2～9分。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)方法:采用RT-PCR法檢測(cè)CARD9、PKM2、CMTM6表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟：將1mL TRNzol加入癌組織、癌旁組織取總DNA并檢測(cè)其純度和濃度，提取2μg總DNA并加入內(nèi)參GAPDH及目的小分子RNA CARD9、PKM2、CMTM6逆轉(zhuǎn)錄引物，42℃ 15min，85℃ 5s，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性10min，95℃、60℃、95℃、60℃、95℃時(shí)間分別12s、40s、15s、30s、15s(收集熒光)，40個(gè)循環(huán)，使用Primer5.0軟件對(duì)引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)以ddH2O設(shè)為陰性對(duì)照，CARD9引物序列上游：5'-CCGCGTCTTCTCCATGAT-3'，下游：5'-CCGCAGCTCCTTGATGAA-3'；PKM2引物序列上游：5'-GGTGTTTGCGTCATTCATCC-3'，下游：5'-ACCGTCCAATCATCATCTTCTG-3'；CMTM6引物序列上游：5'-AGGCAATAGGTCAGTAAGGTCAGTAGG-3'，下游：5'-GTCCAGAAGCAGTCAGTCTCAAGTC-3'；內(nèi)參GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

1.2.4計(jì)算公式:靈敏度=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性)×100%，診斷效率=真陽(yáng)性+真陰性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性+真陰性+假陰性)。

2 結(jié) 果

2.1CARD9、PKM2、CMTM6在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較:CARD9、PKM2、CMTM6在癌組織中表達(dá)均高于癌旁組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=61.610、52.920、54.510，均P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1、圖2、圖3。

表1 CARD9 PKM2 CMTM6在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較

圖1 CARD9在癌組織、癌旁組織中免疫組織化學(xué)染色圖(×200)a：癌組織；b：癌旁組織

圖2 PKM2在癌組織、癌旁組織中免疫組織化學(xué)染色圖(×200)a：癌組織；b：癌旁組織

圖3 CMTM6在癌組織、癌旁組織中免疫組織化學(xué)染色圖(×200)a：癌組織；b：癌旁組織

2.2CARD9、PKM2、CMTM6與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析:CARD9、PKM2、CMTM6與乳腺癌患者年齡、腫瘤部位、病理類(lèi)型、絕經(jīng)情況、腫瘤大小無(wú)關(guān)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。低分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者CARD9、PKM2、CMTM6表達(dá)高于高中分化程度、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 CARD9 PKM2 CMTM6與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

2.3CARD9、PKM2、CMTM6之間相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)性分析顯示，CARD9、PKM2之間正相關(guān)(r=0.257，P=0.022)；CARD9、CMTM6之間正相關(guān)(r=0.260，P=0.021)；PKM2、CMTM6之間正相關(guān)(r=0.254，P=0.024)，見(jiàn)圖4。

圖4 CARD9、PKM2、CMTM6之間相關(guān)性圖

2.4CARD9、PKM2、CMTM6對(duì)乳腺癌的預(yù)測(cè)價(jià)值:分別繪制CARD9、PKM2、CMTM6單項(xiàng)和三者聯(lián)合對(duì)乳腺癌診斷的ROC曲線，結(jié)果顯示，CARD9、PKM2、CMTM6單項(xiàng)檢測(cè)診斷乳腺癌的ROC曲線下面積分別為716(95%CI：0.591～0.840)、0.653(95%CI：0.531～0.774)、0.735(95%CI：0.611～0.860)，而CARD9、PKM2、CMTM6聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.833(95%CI：0.741～0.925)，見(jiàn)表3、圖5。

圖5 CARD9、PKM2、CMTM6診斷乳腺癌的ROC曲線圖

表3 CARD9 PKM2 CMTM6診斷乳腺癌的效能分析

3 討 論

乳腺癌患者早期時(shí)不具備典型的癥狀和體征，常在體檢或乳腺癌篩查中被發(fā)現(xiàn)，此病的典型體征包括乳腺腫塊、乳頭溢液、皮膚改變、腋窩淋巴結(jié)中以及乳頭或乳暈異常等[5]。目前臨床多采用手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療乳腺癌等，盡管治療手段不斷進(jìn)步，仍有部分乳腺癌患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗，故從分子角度闡明乳腺癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)機(jī)制，尋找乳腺癌新的分子靶標(biāo)，對(duì)于完善乳腺癌患者的治療和提高預(yù)后意義重大[6]。

臨床研究證實(shí)，癌癥的發(fā)生與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為相關(guān)，其中細(xì)胞中病理、生理因子可通過(guò)不同的初級(jí)信號(hào)介導(dǎo)凋亡，而凋亡的最終通路均為胱天蛋白酶的激活[7]。CARD9是CARD蛋白酶家族主要成員之一，具有胱天蛋白酶激活的作用，在多種原發(fā)性腫瘤組織中呈異常高表達(dá)，通過(guò)形成CARD-CARD結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)并參與細(xì)胞生物學(xué)行為[8]。有研究顯示[9]，CARD9是一個(gè)調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-KB等信號(hào)通路的重要的因子，CARD9高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，提示其可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，研究結(jié)果證實(shí)CARD9與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)，但與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。在本文研究中，CARD9在癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，說(shuō)明其在乳腺癌中呈高表達(dá)；高中分化程度CARD9高于低分化程度，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CARD9高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ⅲ～Ⅳ期CARD9高于Ⅰ～Ⅱ期，說(shuō)明隨著分化程度加重、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期加重，CARD9越高。

PKM2是一種限速酶，在糖酵解途徑中顯得尤為重要，其在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，在腫瘤的代謝過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在賀帥[10]等研究中，糖代謝異常在乳腺癌進(jìn)展中起重要作用，糖酵解可產(chǎn)生大量乳酸，為糖異生提供原料，此外導(dǎo)致外周組織對(duì)葡萄糖的利用障礙，有氧糖酵解和糖代謝異常相互作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，PKM2在有氧糖酵解的建立以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用。姚奧[11]等研究，PKM2在細(xì)胞質(zhì)中與其他糖酵解酶共同構(gòu)成糖酵解酶復(fù)合體，為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝提供能量并保證其長(zhǎng)時(shí)間繁殖。本研究PKM2在乳腺癌患者中呈高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解的催化作用，促進(jìn)細(xì)胞糖酵解、增殖，且為癌細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需能量。本文研究結(jié)果表明，PKM2在乳腺癌組織中高表達(dá)，高中分化程度PKM2高于低分化程度，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PKM2高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ⅲ～Ⅳ期PKM2高于Ⅰ～Ⅱ期，說(shuō)明隨著分化程度加重、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期加重，PKM2越高。

CMTM6是CMTM家族主要成員之一，可激活和趨化大量免疫細(xì)胞并對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲產(chǎn)生影響。臨床實(shí)踐表明，CMTM6在肺腺癌患者中表達(dá)上調(diào)，且與患者臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，且與PD-L1水平密切相關(guān)[12]。馮曉波[13]等研究，CMTM6在口腔鱗癌中呈高表達(dá)，且與PD-1、PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)，表明其與PD-1、PD-L1在調(diào)控腫瘤微環(huán)境的免疫反應(yīng)中具有協(xié)同作用，其機(jī)制可能為激活或加強(qiáng)PD-1/PD-L1信號(hào)通路，發(fā)揮免疫抑制的作用。楊小駿[14]等研究，CMTM6在乳腺癌中表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與乳腺癌病理分型、HER2陽(yáng)性顯著、患者預(yù)后相關(guān)，CMTM6高表達(dá)是乳腺癌預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在本文研究中，CMTM6癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，說(shuō)明其在乳腺癌中呈高表達(dá)，高中分化程度CMTM6高于低分化程度，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CMTM6高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ⅲ～Ⅳ期CMTM6高于Ⅰ～Ⅱ期，說(shuō)明隨著分化程度加重、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期加重，CMTM6越高。

綜上所述，CARD9、PKM2、CMTM6與乳腺癌患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，CARD9、PKM2、CMTM6兩兩之間呈線性相關(guān)，且均參與乳腺癌的發(fā)生和演變過(guò)程，有望成為乳腺癌無(wú)創(chuàng)診斷的一種新手段，為乳腺癌的早期診治提供一定的理論參考。但本文研究存在樣本量較少、病例來(lái)源受地域限制、指標(biāo)不夠全面不足，故在后續(xù)研究中需開(kāi)展多中心、多樣本的研究，為臨床提供可靠依據(jù)。